生物体液中10种蟾蜍毒素的UPLC-MS/MS检测

曹振宇, 董颖, 刘剑, 张宏民, 苗丽文

刑事技术 ›› 2024, Vol. 49 ›› Issue (4) : 375-382. DOI: 10.16467/j.1008-3650.2023.0071
论著

生物体液中10种蟾蜍毒素的UPLC-MS/MS检测

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Detection of 10 Bufotoxins in Biological Fluids Using UPLC-MS/MS

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摘要

本文建立了人的血液、尿液中10种蟾蜍毒素（沙蟾毒精、日蟾蜍它灵、酯蟾毒精、去乙酰华蟾蜍精、酯蟾毒配基、华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾酥毒基、蟾毒灵、华蟾毒精醇）的超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q/Exactive MS）的检测方法。取血液或尿液0.2 mL，先加入0.8 mL乙腈沉淀蛋白，后用Hybird固相柱进行净化。选用ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm×1.8 µm）色谱柱，流动相A相为0.1%甲酸水，B相为乙腈，采用梯度洗脱分离。质谱采用电喷雾离子源，正离子模式进行分析。该方法在血液、尿液中对于10种蟾蜍毒素的检出限均可在10 ng/mL以内，最低可以达到0.1 ng/mL。10种蟾蜍毒素的血、尿基质添加在20~400 ng/mL范围内线性良好（R2>0.995）。血、尿中10种蟾蜍毒素的提取回收率在65.0%~97.7%之间，基质效应在90.8%~109.0%之间，日内精密度在9.6%之内，日间精密度在14.7%之内，在基质中的反复冻融稳定性、常温稳定性和提取后稳定性良好，浓度的RSD变化均在15%以内。用本文建立的方法对动物实验中收集到的血液进行分析，结果表明10种蟾蜍毒素均可检出。该方法灵敏度高，适用性广，可以用于蟾蜍毒素中毒类案件的检验鉴定。

Abstract

A method was developed for the detection of 10 bufotoxins (arenobufagin, gamabufotalin, resibufagin, desacetylcinobufagin, resibufogenin, cinobufotalin, bufotalin, cinobufagin, bufalin, and cinobufaginol) in human blood and urine by ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field orbital trap high resolution mass spectrometry (UPLC-Q/Exactive MS). 0.8 mL of acetonitrile was added in 0.2mL of blood or urine to precipitate proteins, and then was purified with a Hybird solid phase column. A ACQUITY UPLC HSS T3 column (2.1 mm×100 mm×1.8 µm) was selected. The mobile phase A consisted of 0.1% formic acid in water and B consisted of acetonitrile with a gradient elution program for separation. The mass spectrum was analyzed by electrospray ion source and positive ion mode. The detection limit of 10 bufotoxins in blood and urine can be less than 10ng/mL, and the lowest can reach 0.1 ng/mL. The calibration curves of 10 bufotoxins were in good linear over the range from 20ng/mL to 400ng/mL (R2 > 0.995) in spiked blood and urine matrix. The extraction recoveries of 10 bufotoxins from blood and urine ranged from 65% to 97.7%, the matrix effect ranged from 90.8% to 109.0%, the intraday precision was within 9.6%, and the interday precision was within 14.7%. The stabilities of 10 bufotoxins in the matrix were good under repeated freezing and thawing condition, room temperature condition, and extraction processing, with the RSD of concentration all within 15%. The method was used to analyze the body fluids collected in animal experiments. The results showed that all 10 bufotoxins had been detected. This method has high sensitivity and broad applicability, and can be used for the identification in bufotoxin poisoning cases.

关键词

法医毒物分析 / 蟾蜍毒素 / 生物样本 / 质谱检测

Key words

forensic toxicology analysis / bufotoxin / biological samples / mass spectrometry detection

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曹振宇 , 董颖 , 刘剑 , 张宏民 , 苗丽文. 生物体液中10种蟾蜍毒素的UPLC-MS/MS检测. 刑事技术. 2024, 49(4): 375-382 https://doi.org/10.16467/j.1008-3650.2023.0071
CAO Zhenyu , DONG Ying , LIU Jian , ZHANG Hongmin , MIAO Liwen. Detection of 10 Bufotoxins in Biological Fluids Using UPLC-MS/MS. Forensic Science and Technology. 2024, 49(4): 375-382 https://doi.org/10.16467/j.1008-3650.2023.0071
蟾蜍毒素主要分泌于蟾蜍的耳后腺中，有剧毒，毒性表现为强烈的心脏毒性或致幻性。在生物体内可引发恶性心律失常，严重可导致心脏骤停而死亡。在我国沿海和有食用蟾蜍习惯的地区，因食材处理不当或误食而引发蟾蜍毒素中毒的案例时有发生。蟾蜍毒素大体可分为蟾蜍二烯内酯类和吲哚生物碱类[1]，在我国引发中毒事件的主要是蟾蜍二烯内酯类物质。蟾蜍毒素也有很大的药用潜力，其中的蟾蜍二烯内酯类物质在抗肿瘤[2]、免疫调节[3]、抗病毒[4]、强心[5]等方面都有着显著的功效。吲哚生物碱类主要作用于神经系统，其中5-MeO-DMT有强致幻性[6]，有研究表明5-MeO-DMT对脑神经营养因子有良性的调节作用[7]。
本文使用具有高分辨率的Q/Exactive组合型四极杆质谱，对10种结构相似的常见蟾蜍毒素进行了区分和检测，并首次建立了血液和尿液中蟾蜍毒素的UPLC-Q/Exactive MS检测方法。本方法具有前处理简单快捷、灵敏度高、应用广泛的特点，适用于各类案件中蟾蜍毒素的检验鉴定。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

仪器：Vanquish Flex超高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Q/Exactive静电场轨道阱高分辨质谱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；CUTEMIXER CM-1000高速振荡器（日本EYELA公司）；vortex Genie 2涡旋振荡器（美国SI仪器公司）；自动移液枪（法国GILSON公司）；Milli-Q Academic超纯水器（美国Millipore公司）；XS105DU电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；Biofuge Primo R台式高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）。
试剂：甲酸（LC-MS级）、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。超纯水由纯水器制备，所得超纯水电阻率为18.2 MΩ·cm。
标准品：沙蟾毒精乙腈溶液、日蟾蜍它灵乙腈溶液、酯蟾毒精乙腈溶液、去乙酰华蟾蜍精乙腈溶液、酯蟾毒配基乙腈溶液、华蟾毒它灵乙腈溶液、蟾毒它灵乙腈溶液、华蟾酥毒基乙腈溶液、蟾毒灵乙腈溶液、华蟾毒精醇乙腈溶液。上述标准品浓度均为100 μg/mL，均购自天津阿尔塔科技有限公司。将10种蟾蜍毒素标品用乙腈配制为10 μg/mL的混合标准液作为储备液，4℃冰箱储存备用。
耗材：Hybrid固相萃取柱；医用1 mL注射器；0.22 μm有机膜。

1.2 仪器条件

1.2.1 液相色谱条件

选用Waters ACQUITY UPLC HSS T3液相色谱柱（2.1 mm×100 mm×1.8 µm）；柱温箱温度设为40℃；流动相A为0.1%甲酸水，流动相B为乙腈，流速0.4 mL/min，流动相采用梯度洗脱方式，洗脱程序见表1；采集时间18 min；进样体积3 μL。
表1 液相色谱梯度洗脱条件

Table 1 Gradient elution conditions of liquid chromatography

时间/min 流动相A/% 流动相B/%
0.0 90 10
0.8 90 10
2.0 70 30
12 60 40
14 10 90
16 10 90
16.1 90 10
18 90 10

1.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子扫描；采集方式：平行反应监测（PRM）；电喷雾电压：3.0 kV；离子源温度：500℃；毛细管温度：320℃；雾化气为氮气。10种蟾蜍毒素标准品在高分辨质谱的精确质量数和优化后的碰撞能数值见表2。
表2 10种蟾蜍毒素的基本信息及质谱条件

Table 2 Basic information and mass spectrometry conditions of 10 bufotoxins

序号 中文名 英文名 分子式 碰撞能 [M+H]+精确质量 子离子精确质量
1 沙蟾毒精 Arenobufagin C24H32O6 43 417.2256 399.2146*、356.5407
2 日蟾蜍它灵 Gamabufotalin C24H34O5 40 403.2464 385.2362*、349.2151
3 酯蟾毒精 Resibufagin C24H30O5 35 399.2152 239.1783*、257.1889
4 去乙酰华蟾蜍精 Desacetylcinobufagin C24H32O5 43 401.2306 159.1166*、107.0858
5 酯蟾毒配基 Resibufogenin C24H32O4 30 385.2358 367.2275*、349.2162
6 华蟾毒它灵 Cinobufotalin C26H34O7 25 459.2360 363.1941*、201.1638
7 蟾毒它灵 Bufotalin C26H36O6 30 445.2569 349.2151*、367.2257
8 华蟾酥毒基 Cinobufagine C26H34O6 30 443.2412 365.2111*、215.1794
9 蟾毒灵 Bufalin C24H34O4 35 387.2515 255.2099*、351.2305
10 华蟾毒精醇 Cinobufaginol C26H34O7 30 459.2362 151.0386*、363.1945
注：*为定量离子。

1.3 提取步骤

取待测血液或尿液0.2 mL，加入0.8 mL乙腈，振荡10 min，12 000 r/min离心10 min，吸取上清液过Hybrid固相萃取柱，流速1.0 mL/min，加入1 mL乙腈进行淋洗，合并滤过液和淋洗液于玻璃试管中，在50 ℃温度下吹干，200 μL乙腈溶解定容，过0.22 μm有机系微孔滤膜，供UPLC-Q/Exactive MS分析。

2 结果与讨论

2.1 提取条件优化

本研究在提取时，比较了使用Hybrid固相柱配合沉淀蛋白和仅沉淀蛋白情况下待检蟾蜍毒素的回收率。Hybrid固相柱可以对检材中的磷脂进行有效净化，以起到改善回收率和基质效应的作用。在添加浓度为0.1 μg/mL时，血、尿基质两种提取方法的回收率见图1和图2。可以明显看出在使用Hybrid固相柱的情况下，各个毒素在基质中的提取回收率都有了一定的提升。
图1 血液中不同前处理方式的回收率比较

Fig.1 Comparison of recoveries by different pretreatment methods in blood

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图2 尿液中不同前处理方式的回收率比较

Fig.2 Comparison of recoveries by different pretreatment methods in urine

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2.2 色谱条件优化

为了将10种蟾蜍毒素在色谱图中清晰地分别开来，本文对色谱有机相的甲醇和乙腈、水相的纯水和0.1%甲酸−水的分离效果进行了考察，结果表明10种化合物在0.1%甲酸−水−乙腈体系中离子化效率更高、峰型更好。色谱柱则分别考察了Waters BEH C18 (2.1 mm×100 mm×1.7 μm)柱、Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm×1.8 µm）柱和Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×150 mm×1.8 µm）柱分离效果，结果发现使用Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm×1.8 µm）柱的分离效果最佳。故最终确定以0.1%甲酸水−乙腈流动相、Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm×1.8 µm）色谱柱为液相色谱条件。最终分离结果见图3，图中各毒素进样浓度为0.1 μg/mL。
图3 10种蟾蜍毒素的色谱图

Fig.3 Chromatograms of 10 bufotoxins

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2.3 质谱条件优化

分别使用浓度为0.1 μg/mL的10种蟾蜍毒素标准品，在电喷雾离子源正离子模式下进样，经过优化，挑选出能使母离子达到最佳碎裂状态的碰撞能（CE）值。确定CE值后，在二级质谱图中挑选质荷比较大、干扰小且响应较高的两个子离子，其中响应最高的作为定量离子，响应较低的作为辅助定性离子。最终优化结果见表2。
本实验在Q/Exactive高分辨质谱的PRM模式下，可以直接在一级质谱图中提取母离子进行定量分析，表2中经优化挑选出的子离子对可以在四极杆质谱的多重反应监测（MRM）模式下使用。

2.4 方法学验证

2.4.1 方法专属性考察

取空白血液、尿液样本，加入一定量的混合标准溶液，用1.3所描述的方法进行提取，同时对空白血液和尿液进行提取分析，将二者的分析图谱进行比较。在空白血、尿基质的图谱中，10种蟾蜍毒素保留时间附近均未出现明显色谱峰，表明生物基质中内源性杂质不会对此类毒素的测定造成干扰，说明本项目建立的提取方法具有较高的专属性。空白血样、尿样色谱图见图4、图5。
图4 空白血样提取后色谱图

Fig.4 Chromatograms of blank blood after extraction

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图5 空白尿样提取后色谱图

Fig.5 Chromatograms of blank urine after extraction

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2.4.2 线性范围、检出限（LOD）和定量限（LOQ）

取0.2 mL血液或尿液的空白样本，分别添加浓度为100 ng/mL的混合标准溶液20、40、80 μL，1 μg/mL的混合标准溶液20、30、50、60、80 μL，得到浓度为10、20、40、100、150、250、300、400 ng/mL的添加样品。按照1.2条件进行提取分析，每种检材的每个浓度平行处理3份。以待测目标物浓度为横坐标（x，ng/mL），待测物一级母离子峰面积为纵坐标（y）建立标准曲线。拟合得到的线性方程和R2值见表3。
表3 血、尿添加样品中10种蟾蜍毒素的线性范围、线性方程、决定系数、检出限及定量限

Table 3 The linear ranges, linear equations, coefficients of determination, LODs and LOQs of 10 bufotoxins in blood and urine

毒素名称 基质 线性范围/（ng/mL） 线性方程 决定系数/R2 LOD/（ng/mL） LOQ/（ng/mL）
沙蟾毒精 血
尿		 20~400
20~400		 y=1956.4x-20853
y=1956.4x-20853		 0.9953
0.9952		 10
10		 20
20
日蟾蜍它灵 血
尿		 20~400
10~400		 y=8089.9x+424451
y=10274x+80115		 0.9962
0.9981		 1
1		 20
10
酯蟾毒精 血
尿		 10~400
10~400		 y=22022x+228144
y=19301x+319262		 0.9952
0.9980		 1
1		 10
10
去乙酰华蟾蜍精 血
尿		 10~400
10~400		 y=32862x+218242
y=26986x+498974		 0.9967
0.9955		 1
1		 10
10
酯蟾毒配基 血
尿		 10~400
10~400		 y= 9184x+141759
y=7204.2x+123602		 0.9980
0.9972		 1
1		 10
10
华蟾毒它灵 血
尿		 10~400
10~400		 y=6536.1x+49370
y=5117.1x+69073		 0.9977
0.9970		 1
1		 10
10
蟾毒它灵 血
尿		 10~400
10~400		 y=31772x+369332
y=31781x+892179		 0.9968
0.9970		 1
1		 10
10
华蟾酥毒基 血
尿		 10~400
10~400		 y=12912x+129771
y=10102x+106545		 0.9994
0.9954		 1
1		 10
10
蟾毒灵 血
尿		 10~400
10~400		 y=27920x+478512
y=25499x+518353		 0.9982
0.9963		 0.1
0.1		 10
10
华蟾毒精醇 血
尿		 10~400
10~400		 y=10922x+166195
y=10681x+230745		 0.9962
0.9960		 1
1		 10
10
同样取0.2 mL血液、尿液的空白样本，添加10 ng/mL和1 ng/mL的混合标准溶液20 μL，得到浓度为1 ng/mL和0.1 ng/mL的添加样品。以待测毒素色谱峰信噪比（S/N）>3确定检出限，以信噪比（S/N）>10确定定量限，数据同见表3。除沙蟾毒精和血液基质中日蟾蜍它灵的线性范围在20~400 ng/mL外，其余毒素在不同基质中的线性范围均为10~400 ng/mL，线性范围内线性关系良好，R2均在0.995以上。

2.4.3 回收率和基质效应

在线性范围内选取20、400 ng/mL两个浓度进行回收率和基质效应实验。在血、尿两种空白样本中加入相应混合标准溶液，按照1.3进行提取，每个浓度每种基质平行处理6份。按1.2仪器条件进行分析，测得目标物峰面积A1，再取20 ng/mL和400 ng/mL浓度的混合标准溶液进样分析，测得目标物峰面积A3，回收率=A1/A3×100%。回收率数据见表4。由数据可知10种蟾蜍毒素在2种基质中的提取回收率在65.0%~97.7%之间，表明本方法的前处理方法对目标物的损耗较少。
表4 血、尿样本中10种蟾蜍毒素的回收率

Table 4 The recoveries of 10 bufotoxins in blood and urine

毒素名称 血液中回收率/% 尿液中回收率/%
20 ng/mL 400 ng/mL 20 ng/mL 400 ng/mL
沙蟾毒精 77.4 76.3 93.6 86.8
日蟾蜍它灵 71.1 75.0 76.0 83.0
酯蟾毒精 73.2 82.9 80.7 95.4
去乙酰华
蟾蜍精		 77.8 83.7 85.9 90.3
酯蟾毒配基 74.6 65.0 74.2 68.6
蟾毒灵 81.3 88.9 82.9 76.4
华蟾毒它灵 74.3 80.2 67.4 75.7
蟾毒它灵 75.2 75.9 85.8 84.3
华蟾酥毒基 86.7 70.3 84.6 71.8
华蟾毒精醇 84.4 85.1 97.7 89.5
采用后加入的方法进行血、尿中的基质效应考察，分别取空白的血液和尿液样本，按照1.3进行处理，得到空白基质提取液，以此为溶剂配制浓度为20 ng/mL和400 ng/mL的标准混合溶液，按照1.2条件分析，测得目标物峰面积A2。基质效应= A2/A3×100%，10种蟾蜍毒素在2种基质中基质效应在90.8%~108.7%之间，表明提取过程中基质效应影响不大。具体数据见表5。
表5 血、尿样本中10种蟾蜍毒素的基质效应

Table 5 Matrix effects of 10 bufotoxins in blood and urine

毒素名称 血液基质效应/% 尿液基质效应/%
20 ng/mL 400 ng/mL 20 ng/mL 400 ng/mL
沙蟾毒精 105.7 101.5 104.7 99.2
日蟾蜍它灵 102.9 96.9 90.8 105.5
酯蟾毒精 99.0 99.4 96.0 108.2
去乙酰华
蟾蜍精		 100.5 94.6 97.8 108.7
酯蟾毒配基 102.2 101.2 98.6 91.2
蟾毒灵 98.4 92.0 108.2 101.0
华蟾毒它灵 101.3 98.7 98.6 103.2
蟾毒它灵 106.3 103.3 94.4 95.9
华蟾酥毒基 99.1 94.7 104.0 94.8
华蟾毒精醇 101.9 95.7 94.3 102.2

2.4.4 精密度实验

在线性范围内选取20、100、400 ng/mL共计3个浓度进行精密度实验。在空白的血样、尿样中加入适量的标准溶液，使其在每一种基质中的添加浓度为20、100、400 ng/mL，每份样品1日内平行进样6次，计算各组分峰面积的相对标准偏差（RSD），得到日内精密度。配制同样浓度添加溶液提取后分别于6日内分析，计算各组分峰面积间的RSD值得到日间精密度。10种蟾蜍毒素在不同基质中日内精密度在9.6%以内，日间精密度可以控制在14.7%以内，具体数据见表6。
表6 血、尿样本中10种蟾蜍毒素的日内、日间精密度

Table 6 Intraday and interday precisions of 10 bufotoxins in blood and urine

毒素名称 添加浓度/（ng/mL） 血中精密度/% 尿中精密度/%
日内RSD 日间RSD 日内RSD 日间RSD
沙蟾毒精 20
100
400		 9.1
9.4
7.2		 12.0
11.5
13.4		 6.5
4.4
5.8		 11.0
8.3
7.4
日蟾蜍它灵 20
100
400		 8.5
9.4
7.0		 9.2
10.4
13.8		 8.9
8.5
7.2		 12.5
10.5
13.3
酯蟾毒精 20
100
400		 6.4
4.8
6.9		 7.1
11.6
8.0		 5.4
5.0
6.9		 11.2
11.6
14.6
去乙酰华蟾蜍精 20
100
400		 7.1
6.8
7.3		 9.0
10.8
11.3		 4.2
4.7
7.2		 8.4
9.7
8.6
酯蟾毒配基 20
100
400		 7.0
4.6
7.4		 12.4
12.7
9.1		 6.0
8.6
3.9		 8.3
12.1
13.4
蟾毒灵 20
100
400		 5.5
2.5
6.8		 9.1
11.6
8.6		 4.6
4.7
8.6		 7.4
8.4
13.9
华蟾毒它灵 20
100
400		 4.9
5.2
6.1		 11.7
8.7
9.3		 7.9
8.9
6.1		 11.7
13.3
6.7
蟾毒它灵 20
100
400		 6.0
3.3
6.0		 6.9
6.0
6.9		 5.9
4.8
8.1		 8.9
5.6
10.1
华蟾酥毒基 20
100
400		 5.6
4.1
7.8		 9.3
13.4
12.8		 7.5
9.6
6.6		 7.9
11.7
14.7
华蟾毒精醇 20
100
400		 4.9
7.4
6.9		 11.6
8.2
7.6		 7.0
2.0
6.9		 9.3
7.7
14.0

2.5 稳定性实验

2.5.1 反复冻融稳定性

取空白的血样、尿样，加入适量的标准溶液，使其在每一种样品中的添加浓度为20 ng/mL和400 ng/mL，每个浓度平行6次。样品添加后做三个冻融循环，每个循环先在−20℃下保存21 h，解冻后室温25℃下放置3 h按照1.3进行提取，每次循环提取得到的样品中毒素浓度与添加后立刻进行提取得到的毒素浓度相比较。

2.5.2 常温短期稳定性

取空白的血样、尿样，加入适量的标准溶液，使其在每一种样品中的添加浓度为20和400 ng/mL，每个浓度平行重复6次。添加后在室温25 ℃放置24 h后按照1.3进行提取，经室温放置的样品峰中毒素浓度与添加后立刻提取的毒素浓度进行比较。

2.5.3 提取后样品稳定性

取空白的血样、尿样，加入适量的标准溶液，使其在每一种样品中的添加浓度为20、400 ng/mL，每个浓度平行重复6次。样品按照1.3提取分析后在4 ℃条件下保存24 h后再进行分析，将放置前后的样品中毒素浓度相比较。
经分析比对，本文所研究的10种蟾蜍毒素在经过冻融循环、室温下保存24 h和提取后4℃保存24 h后，在血液、尿液中浓度变化的RSD值均在15%以内，表明在实验全过程中实验数据稳定可靠。

3 方法验证

使用昆明种系的SD成年大鼠作为实验用动物进行蟾酥粉灌胃实验，蟾酥为蟾蜍耳后腺分泌物干燥加工后所得，主要成分为蟾蜍毒素。取大鼠雌、雄各4只，随机挑选1雄1雌为阴性对照组，其余6只为给药组。给药组按照蟾酥粉的半数致死量（LD50）经口进行灌胃，对照组灌以等量的生理盐水。蟾酥粉使用江苏京蟾生物有限公司生产的蟾酥粉，符合2020版《中国药典》的质量要求。小鼠的LD50值为600.6 mg/kg[8]，按照体表面积换算法得到大鼠的LD50为289.4 mg/kg[9]。灌胃后观察3 h，经麻醉处死后由小鼠的腹主动脉采集血液备检。解剖未取到大鼠尿液。
按照1.3提取采集的大鼠血液，按1.2的仪器参数进行分析，在给药组血样中检出上文所研究的沙蟾毒精等10种蟾蜍毒素，证明本文所建立的方法可以用于生物体液中蟾蜍毒素的检测。此次动物实验已通过公安部鉴定中心科研伦理委员会审查。

4 小结

本文用乙腈沉淀蛋白配合Hybird固相柱净化进行前处理，建立了适用于血液和尿液中，10种常见蟾蜍毒素的超高效液相色谱−串联质谱的分析方法。蟾蜍毒素中毒具有潜伏期短、死亡率高等特点，加强该类毒素的检测能力，可以为临床抢救争取时间，也可以为法庭科学的论证提供技术支撑。

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中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2021JB013)

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