GC7820A气相色谱仪（美国Agilent公司）; DS-8510DTH超声波清洗器（上海生析超声波仪器公司）; 0.32 mm石英毛细管（河北永年锐丰色谱器材公司）; GCB（Carbopack A, 美国Supelco公司）; 聚乙二醇-硝基对苯二酸改性（FFAP）固定相（德国CNW公司）; 无水乙醇、正十二烷（C₁₂）和单标试剂（纯度≥ 99%）（阿拉丁上海试剂公司）; 白酒中的53种微量组分标准品混合液（兰州东立龙色谱技术有限公司）。

LZP-903G色谱柱的制备方法同文献^[18]。首先采用超声处理过的GCB悬浊液对石英毛细管内壁进行预处理, 随后用FFAP试剂在280 ℃钝化处理10 h, 最后用5 mL CH₂Cl₂溶液清洗2次后采用静态法涂覆色谱柱。色谱柱涂制完成后在250 ℃老化10 h即可。

色谱条件：高纯氮气为载气, 进样器温度为230 ℃, 分流进样, 进样量1 μ L, FID检测器, 温度为230 ℃, 采用程序升温对混合标样进行分析, 用保留时间进行定性分析。

色谱柱性能测试：用C₁₂为测试试剂, 以甲烷的保留时间作为死时间, 测定柱温为120 ℃恒温时色谱柱的理论塔板高度（H）与平均流速（u）曲线（H-u曲线）, 计算最佳载气线速度（u_opt）; 在最佳载气线速度的条件下, 测定其柱效（N）、保留因子（k）和McReynolds常数（Δ I）, 所得测定结果见表1。由表可以看出所制备的色谱柱性能良好, 与前期文献结果一致。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 色谱柱性能参数 Table 1 Parameters of the chromatographic column 色谱柱 N/ (块/m) k uopt/ (cm/s) McReynolds 常数（Δ I） 极性 X’ Y’ Z’ U’ S’ (∑ Δ I) LZB-930G 2350 2.5 10 272 477 337 508 515 2109

表1 色谱柱性能参数 Table 1 Parameters of the chromatographic column

样品制备及方法：采用60%（体积分数）乙醇/水溶液为溶剂对混合标样进行逐级稀释, 分别得到2倍、5倍、10倍和20倍稀释后的系列混合样品, 进行线性回归分析; 选用5倍稀释样品进行相对标准偏差（RSD, %）和分离度（R）、校正因子的测定, 取5次分析结果为平均校正因子; 选用5倍和20倍稀释的样品作为高、低浓度进行加标回收实验, 添加浓度为各组分含量的20%; 市售白酒样品分析时, 以3倍S/N作为组分的检出限, 用内标法进行定量计算, 内标叔戊醇用于异丁醇前的组分分析, 内标乙酸正戊酯用于正丙醇与辛酸乙酯间的组分的分析, 内标2-乙基正丁酸用于糠醛后高沸点组分分析。

图1为色谱柱的H-u流速曲线。可以看出所制备的色谱柱具有较好的分离性能, 在载气线速度为10 cm/s时, LZP-930G具有最小理论塔板高度, H_min为4.8× 10^-4 m, N为2350块/m; 当线速度在7~14 cm/s范围内变化时, H变化并不明显。这表明载气流速在最佳流速左右变化时, 色谱柱的分离性能不会发生明显的改变, 因此, 为了提高分析方法的效率, 选择载气流速为12 cm/s（85 kPa）的分析条件来对组分的保留行为进行研究。

图1

Fig.1

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	图1 色谱柱的H-u曲线Fig.1 The H-u curves of the column

如图2所示, 采用恒流模式分析时（图2a）, 有4对组分的色谱峰表现为重叠峰, 分别为丙酮和甲酸乙酯（3/4）、乳酸乙酯和正己醇（28/29）、异戊酸和糠醇（40/41）、己酸和苯乙酸乙酯（46/47）; 而采用恒压模式分析时（图2b）, 虽然低沸点组分的分离特征未发生明显改变, 但是高沸点组分的分离选择性却得到了明显提高, 尤其是恒流模式下重叠的3对组分均得到了有效分离; 其色谱峰呈现出部分分离的特征, 完全能够达到定性、定量分析的要求。在相同的温度程序条件下, 组分的出峰时间和出峰温度会随着分离模式的不同而存在一定的差别。恒流模式条件下, 随着色谱柱柱温的逐步升高, 较高柱温出峰组分的分配比（K）会逐渐变小, 色谱柱对其保留作用相对减弱, 因此会引起组分的分离选择性下降; 而恒压模式分析时, 色谱柱的柱前压始终保持不变, 载气流速会随着柱温的升高而逐步降低, 由于选择的初始载气流速大于最佳线速度, 这样载气流速的降低反而能够提高色谱柱的柱效, 弥补恒流模式下K值减小的不利影响; 因此, 采用恒压模式对分析进行研究。

图2

Fig.2

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	图2 恒流（a）、恒压(b)模式对分离性能的影响（组分名称及编号见补充材料表S1, 图3~6同）Fig.2 Effect of constant flow rate (a)/pressure (b) on the separation performance (Oven program: 65 ° C for 5 min, 5 ° C/min to 250 ° C for 30 min, column pressure: 85 kPa, splitting volume: 40 mL/min. For peak identification, seen in Table S1. Same indications for Figs 3~6)

图3是调小分流量为25 mL/min所得的色谱图。对比图2b可以看出, 在图3中乙醇前出峰的、低沸点组分的相对峰高变高, 分离度变大, 但是在乙醇后面的高沸点组分中, 乳酸乙酯和正己醇（28/29）、异戊酸和糠醇（40/41）、己酸和苯乙酸乙酯（46/47）等却产生了峰重叠, 这表明分流量变化对组分保留行为的影响作用与组分的沸点有关。考虑到低沸点组分的分离选择性可以通过降低初始柱温来进行改善, 同时为了维持高沸点组分的分离度, 因此, 选择分流量为40 mL/min的分析条件, 考察初始柱温对白酒组分保留行为的影响作用。

图3

Fig.3

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	图3 分流对分离能力的影响Fig.3 Effect of splitting volume on the separation performance (Oven program: 65 ° C for 5 min, 5 ° C/min to 250 ° C for 30 min, splitting volume: 25mL/min, column pressure: 85 kPa)

图4分别为初始柱温为70 ℃和60 ℃时所得的混合标样分离色谱图。与初始柱温为65 ℃时的色谱图（图2b）相比较可以看出, 初始柱温升高为70 ℃时（图4a）, 低沸点和高沸点组分的分离度均有所下降, 其中有4对组分发生了重叠, 原来在温度为65 ℃时能够基线分离的双乙酰和异丁酸乙酯（10/11）、庚酸和β -苯乙醇（49/50）也只能达到部分分离; 当初始柱温降低为60 ℃时（图4b）, 除了异戊酸和糠醇（40/41）的分离度稍有降低外, 其余所有低沸点和高沸点组分的分离都得到了明显提高, 尤其是乙醇前出峰的组分, 获得了良好的分离和相对较高的峰高。以上现象表明初始温度的变化对各组分保留行为的影响作用并不相同, 各组分保留行为变化的差别是组分选择性得到改善的主要原因。另外, 较低的初始温度还具有一定的样品聚焦作用, 当组分由温度较高的汽化室进入温度较低的色谱柱后, 会重新在固定相中进行凝结和浓缩, 形成了较窄的聚焦带, 从而优化了色谱分离条件, 提高了组分的分离选择性。

图4

Fig.4

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	图4 初始温度对分离性能的影响(a:70 ℃; b:60 ℃)Fig.4 Effect of initial oven temperature of (a) 70° C/(b) 60° C on the separation performance (Oven program: 70℃(a)/60° C(b) for 5 min, 5 ° C/min to 250 ° C for 30 min, column pressure: 85 kPa, splitting volume: 40 mL/min)

图5是对升温速率考察的色谱图。对比图5a、5b和图4b（升温速率分别为3 ℃/min、4 ℃/min和5 ℃/min）可以看出, 组分保留行为受温度变化的影响更加明显。乙酸和三甲基吡嗪（31/32）、异戊酸和糠醇（40/41）、己酸和苯乙酸乙酯（46/47）、庚酸和β -苯乙醇（49/50）这4对峰在升温速率逐步减小时, 其分离度表现出先减小后增大的变化过程。当升温速率为3 ℃/min时（图5a）, 乙酸、异戊酸、己酸和庚酸的出峰位置分别移动到了三甲基吡嗪、糠醇、苯乙酸乙酯和β -苯乙醇的后面; 进一步比较其它酸与它们前面组分的相对出峰位置, 能够发现这些酸的相对位置也均发生了后移, 这表明酸类组分的保留性能受温度影响较为明显。

图5

Fig.5

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	图5 升温速率对分离性能的影响（a:3 ℃/min; b:4 ℃/min）Fig.5 Effect of temperature ramp at (a) 3℃/min//(b) 4℃/min on the separation performance (Oven program: 60℃ for 5 min, 3℃/min (a)//4℃/min (b) to 250℃ for 30 min, column pressure: 85 kPa, splitting volume: 40 mL/min)

在70~90 kPa范围内考察了柱前压对组分保留行为的影响作用。结果表明高沸点组分的保留时间随柱前压变化改变明显, 但是组分的分离选择性受柱前压变化的影响非常小。柱前压变化时组分在色谱柱内的迁移速率会随着发生改变, 而迁移速率的变化会对色谱峰的扩张产生影响作用。由色谱柱的H-u曲线（图1）可以看出, 当柱前压在70~90 kPa（u为7~14 cm/s）范围内变化时, 分子的纵向扩散和液相传质阻力所引起的色谱峰扩张变化并不明显, 因此, 柱前压对组分保留行为的影响主要体现在了保留时间的改变, 而对组分分离选择性的影响可以完全忽略。

图6是调整柱前压后得到的最佳色谱分离谱图。由图可以看出, 色谱柱的分离性能得到了进一步的改善, 所有组分均得到了较好的分离, R为1.09~23.85之间（见补充材料表S1）。优化后的白酒分析色谱分离条件为：柱前压80 kPa, 分流量为40 mL/min, 温度程序为初始柱温为60 ℃, 保持5 min后以5℃/min升温至250 ℃。

图6

Fig.6

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	图6 调整柱前压后得到的最佳组分分离色谱Fig.6 Optimal chromatogram obtained with adjusting column pressure (Oven program: 60° C for 5 min, 250 ° C for 30 min, column pressure: 80 kPa, splitting volume: 40 mL/min)

不同种类的白酒中微量组分的含量变化较为明显, 当色谱柱的惰性较差时极性较强的组分容易被色谱柱吸附, 从而会造成样品组分的损失和定量结果准确度降低等问题。这种现象在组分浓度较大时影响并不明显, 但对于含量较低的白酒中的微量组分来说影响却是非常明显的。为此对混合标样进行了逐倍稀释, 在优化的色谱分离条件下进行了线性回归分析, 并对高、低浓度进行了加标回收实验, 考察了组分浓度变化对保留行为的影响作用, 所得结果见补充材料表S1。可以看出在考察的浓度范围内所有组分均能够达到有效分离, 线性关系良好, R²为0.942~0.998, RSD为2.33%~6.81%（n=5）, 高、低浓度水平的添加回收率均在86.1%~115.3%。说明在考察的浓度范围内, 组分浓度的变化未对其保留行为未造成影响。

在优化的色谱条件下, 对市售的5种浓香型、清香型和酱香型白酒中的微量组分进行了测定。结果表明, 混合标样中的目标化合物均能够被检出, 不同香型的酒样中所含微量组分的数量与浓度变化明显, 检出的骨架成分数量在15~25之间（含量大于3 mg/100 mL）, 复杂成分的数量在9~24种之间（见补充材料表S2）, 说明该方法能够实现白酒中的多种微量组分的同时分离分析, 可为白酒的品质、年份酒和纯勾兑酒的司法鉴定提供科学证据。