引用本文
蔡鸿勇, 高林林, 谢炜. 法医DNA实验室剪刀清洗和防污染探析[J].刑事技术, 2022,47(4):423-426
CAI Hongyong, GAO Linlin, XIE Wei. Scissors Cleaning and Preventing against Contamination in Forensic DNA Laboratory[J]. Forensic Science and Technology,2022,47(4): 423-426  
Doi: 10.16467/j.1008-3650.2021.0149
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《刑事技术》编辑部
法医DNA实验室剪刀清洗和防污染探析
蔡鸿勇1, 高林林1, 谢炜2
1.杭州市公安局刑事科学技术研究所,杭州310006
2. 杭州市公安局萧山区分局,杭州 311200

第一作者简介：蔡鸿勇,男,浙江杭州人,学士,警务技术中级任职资格,研究方向为法医物证学。E-mail: 466075417@qq.com

收稿日期: 2021-04-27 修回日期: 2021-08-27
摘要

目的 探索一种法医物证检验过程中简捷有效的剪刀清洗方法。方法 取50把洁净剪刀,用于重度污染（20把）和轻度污染（30把）模拟试验。在重度污染模拟组的每把剪刀刀刃处涂抹血液并于室温晾干后平均分为A、B两组,A组采用清洗机直接清洗,B组采用84消毒液浸泡后再以清洗机清洗;而轻度污染模拟组的30把洁净剪刀,以每把剪取血斑样本后平均分为C、D、E 三组,C组用装有去离子水的喷壶喷洗刀刃,D组用酒精棉擦拭刀刃,E组不做任何处理。用植绒拭子擦拭所有剪刀刀刃,采用磁珠法提取DNA并实时定量,PCR复合扩增与毛细管电泳获取STR分型。结果 B组除1例特殊情况外其余均未检出STR分型,D组均未获得完整STR分型,其余3组均获得部分或完整STR分型。结论 84消毒液浸泡加清洗机清洗可以有效降低实验室剪刀污染。应杜绝重复使用剪刀且只能在样本确定的区域剪取。

关键词: 法医物证学; DNA污染; 剪刀清洗
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2022)04-0423-04
Scissors Cleaning and Preventing against Contamination in Forensic DNA Laboratory
CAI Hongyong1, GAO Linlin1, XIE Wei2
1. Institute of Criminal Science and Technology of Hangzhou Public Security Bureau, Hangzhou 310006, China
2. Hangzhou Municipal Xiaoshan Public Security Sub-bureau, Hangzhou 311200, China
Abstract

Objective To explore a simple and effective method for scissors cleaning about examination of forensic evidential materials.Methods 50 pairs of clean scissors were taken into two simulation tests: one for heavy pollution (20 pairs) and the other for light pollution (30 pairs). For heavy pollution simulation, each pair of clean scissors were smeared with blood on inner sides of the two blades and allowed to dry at room temperature. Such 20 pairs of blood-smeared scissors were evenly allocated into two groups: A and B. Group A was cleaned directly with a cleaning machine while group B was immersed into a solution of 84 disinfectant before the machine cleaning. The 30 pairs of scissors for light pollution simulation were undergone with each pair to cut bloodstained gauzes, consequently having them averaged into three groups: C, D and E. Group C was rinsed with a sprayer containing deionized water while group D was wiped of every blade with alcohol cotton, yet having group E left for no treatment at all. All the tested scissors were wiped with flocking swabs from which DNA was extracted by way of magnetic beads for real-time quantification. The STR genotyping was carried out with PCR amplification and capillary electrophoresis.Results No STR genotyping was revealed in group B with only one unintentional exception while incomplete STR profile was exposed in group D, with partial or totally complete STR profile being uncovered in the other three groups.Conclusions 84 disinfectant immersion plus machine cleaning can effectively eliminate the contamination from forensic laboratory-used scissors. Every pair of scissors should not be used repetitively and had better shear only a certain designated zone with any evidential material.

Key words: forensic biology; DNA contamination; scissors cleaning

近年来, 随着法医DNA检验的灵敏度不断提高, 由脱落细胞二次转移引起的DNA实验室污染事件屡有报道[1, 2, 3, 4], 其中脱落细胞类检材被污染的情况尤为严重, 有人专门统计了DNA实验样本污染的情况, 发现微量生物检材被污染所占比重最大[5]。本实验室内发生的多起样本被污染的情况经追溯分析主因在于剪刀清洗不彻底, 而多数法医DNA实验室由于引进全自动清洗仪器后就对该项工作重视度下降甚或不足, 因此本文尝试探究一种简便有效的剪刀清洗方法以解决交叉污染的问题。

1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂耗材

Q1型清洗消毒机（珠海黑马医学仪器有限公司）, （博坤）全自动24道微量DNA提取工作站（宁波博坤生物科技有限公司）, 4N6FLOQSwabs植绒拭子（意大利Copan公司）, 汰可分专业清洗中和剂（北京瑞德迈普技术开发有限公司）, 84消毒液（江苏爱特福84股份有限公司）, Quantifiler® Trio DNA定量试剂盒、VerifilerPlus扩增试剂盒、QuantStudio5实时荧光定量PCR仪、Veriti PCR扩增仪以及ABI 3500XL型遗传分析仪（美国ThermoFisher公司）。

1.2 方法

1.2.1 样本制备及分组

1）重度污染模拟组：用洁净棉签蘸取新鲜抗凝人血, 均匀涂抹于20把洁净剪刀的2片刀刃内侧面, 将刀刃分开, 悬挂于剪刀架上, 室温放置7 d后均分成A、B两组。A组用Q1型清洗消毒机采用标准程序清洗; B组先用1∶ 100的84消毒液浸泡1 h, 再用Q1型清洗消毒机采用相同的程序清洗, 其中9把刀刃完全打开浸泡, 1把刀刃因意外未完全打开浸泡。

2）轻度污染模拟组：取洁净剪刀30把, 每把剪刀分别剪取血纱布, 将刀刃分开, 悬挂于剪刀架上, 均分成C、D、E三组。C组用装有去离子水的喷壶喷洗刀刃; D组用酒精棉擦拭刀刃; E组未清洗。

1.2.2 DNA提取

用植绒拭子擦拭A~E组所有剪刀的刀刃, 使用（博坤）全自动24道微量DNA提取工作站参照使用说明书提取所有拭子DNA, 洗脱体积为35 μ L。

1.2.3 DNA定量

采用Quantifiler® Trio DNA定量试剂盒在QuantStudio5实时荧光定量PCR仪上进行DNA定量, 扩增体系20 μ L, 其中模板DNA为2 μ L。

1.2.4 PCR扩增及电泳

采用VerifilerPlus试剂盒在Veriti基因扩增仪上进行扩增, 扩增体系10 μ L, 样本模板量7 μ L, 循环数29。所有PCR产物均以3500XL基因分析仪进行毛细管电泳, 所得数据采用GeneMapper ID-X v1.5软件分析。

2 结果
2.1 定量结果

2.1.1 重度污染模拟组结果

A组样本的定量均值为1.015 7 ng/μ L, 最大值1.448 ng/μ L, 最小值0.448 ng/μ L, 标准差SD值为0.389 8。B组样本的定量均值远低于A组, 除1把刀刃未完全打开的剪刀样本（定量值为0.356 ng/μ L）外, 其余9份样本中有1份样本的定量值为0.001 ng/μ L, 另外8份样本均未得到定量数据, 标准差SD值为0.000 3（未统计刀刃未完全打开样本）。

2.1.2 轻度污染模拟组结果

C组样本的定量均值为0.007 8 ng/μ L, 最大值0.022 ng/μ L, 最小值0.001 ng/μ L, 标准差SD值为0.005 8。D组样本的定量均值为0.001 4 ng/μ L, 最大值0.002 ng/μ L, 最小值0.000 ng/μ L, 标准差SD值为0.000 7。E组样本的定量均值为0.018 6 ng/μ L, 最大值0.048 ng/μ L, 最小值0.002 ng/μ L, 标准差SD值为0.015 6。

2.2 STR分型结果

参考行标GA/T 1163-2014《人类DNA荧光标记STR分型结果的分析及应用》, 分型结果应样本图谱清晰, 峰高大于100 RFU; 行标GB/T 37226-2018《法庭科学人类荧光标记STR复合扩增检测试剂质量基本要求》, 等位基因分型标准物及内标的检测判别规则要求每个等位基因分型的峰高均需大于200 RFU。因二次转移造成的污染DNA含量一般是比较少的, 结合本实验仪器试剂灵敏度等多方面综合考虑, 故在本文中笔者将STR分型结果评判标准定义为3类：

1）完整STR分型, 所有基因座RFU值≥ 150, 且未出现等位基因缺失。

2）未检出STR分型, 所有基因座的平均RFU值≤ 150, 绝大部分基因座出现等位基因缺失（如图1, 该样本定量值为0.001 ng/μ L）。

图1 未检出STR分型样本典型图谱, 定量值为0.001ng/μ LFig.1 No STR profile appeared from DNA quantified at 0.001ng/μ L

3）不完整STR分型, 所有基因座的平均RFU值≥ 150, 有个别基因座出现等位基因缺失（如图2, 该样本定量值为0.008 ng/μ L）。

图2 不完整STR分型样本典型图谱, 定量值为0.008ng/μ LFig.2 Emergence of incomplete STR profile from DNA quantified at 0.008ng/μ L

重度污染模拟组中A组所有样本均获得完整STR分型。B组中刀刃未完全打开浸泡的样本获得完整STR分型, 其余9例刀刃打开接受84消毒液浸泡的样本均未检出STR分型。

轻度污染模拟组中C组2例获得完整STR分型, 8例获得不完整STR分型。D组8例未检出STR分型, 2例获得不完整STR分型。E组9例获得完整STR分型, 1例获得不完整STR分型。

3 讨论

剪刀上残存的生物细胞的消杀手段可分为物理和化学两类。有学者认为环氧乙烷能通过化学反应使DNA分子中的氨基和羟基发生烷基化, 其产物能阻碍PCR扩增, 从而可有效阻止人源性DNA污染[6, 7]。此种方法消杀效果可观, 但是处理时间长且环氧乙烷等化学物质具有一定毒性, 对环境要求高, 并不适用于大部分DNA实验室。利用高能量的UV类电磁辐射消杀会引起嘧啶二聚体等DNA损伤甚至DNA分子链的断裂[8]; 利用高能γ 射线等电离辐射[9]消杀则是经产生的游离自由基, 进攻DNA分子而引起DNA分子链的断裂。利用射线消杀的方法虽操作简便但要将片段“ 切割” 至小于STR试剂盒检测阈值, 其所需能量和时间难以估测。传统的物理消杀方式分为机器和/或人工洗涤, 人工洗涤效果好但费时费力, 因此大部分实验室采用机洗, 机洗消杀效果是否会导致实验室污染尚无定论。

本文中重度污染模拟组中A组10把剪刀刀刃上均检出了完整DNA分型。这一结果表明对于重度污染的剪刀, 仅使用消毒清洗机清洗并不足以清除剪刀上遗留的DNA。分析其原因可能与消毒清洗机的工作原理有关。消毒清洗机大部分采用高压动态喷淋的方式, 在相应洗涤消毒剂的作用下对器械进行冲洗, 该洗涤消毒剂不具有破坏DNA链的作用[10], 且冲洗过程中冲洗液与剪刀也未能长时间充分接触。B组10把剪刀中只有1把其刀刃因意外未完全打开导致有完整的STR分型检出, 其余9把基本未残留人源DNA, 此种方法处理后的剪刀符合微量物证检验标准。其原因一方面可能因为84消毒液的主要成分是次氯酸钠, 次氯酸钠遇水稀释后会电离生成次氯酸根（CLO-）, 水解生成次氯酸, 进一步分解就生成新生态氧[O], 这些产物都有极强的氧化性, 不仅会造成DNA分子自身的氧化损伤, 而且使细胞的各种膜结构蛋白质变性, 渗透压发生改变。另一方面剪刀刀刃上残留的人源性DNA由于长时间的浸泡与刀刃的结合变得松散, 易被清洗机彻底从刀刃上冲洗掉。刀刃未完全打开的剪刀在本实验中属意外情况, 概因刀刃未能与含有84消毒液的液体充分接触, 导致消毒失败。此结果虽然由于样本量过少不具备统计学意义, 但却具备一定的实践指导意义。

轻度污染模拟组中, E组有9把剪刀检出了完整分型, 此结果表明重复使用未经清洗的剪刀存在检材间二次转移污染的风险。D组利用酒精棉擦拭与C组利用去离子水冲洗使用过的剪刀都不能较彻底清除剪刀刀刃上残留的DNA。根据上述实验结果, 重复使用剪刀必然存在污染风险。

综上, 法医DNA实验室中使用最多的剪刀、镊子等实验器械, 使用稀释后的84消毒液浸泡加清洗机清洗可有效去除刀刃上残留的DNA, 从而达到较为彻底的消杀效果。在浸泡过程中要特别留心注意剪刀刀刃应呈充分打开状态。此外, 在生物检材样本剪取过程中要杜绝剪刀的重复使用, 因为二次转移污染的DNA虽量微, 但在检案中若检出了即便不完整的分型其也提示污染很可能已发生了。

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