2020年本实验室受理的一起发生于2002年的某女被杀案中所提取的死者内裤布片、血样及其母亲的口腔样本。

1.2.1 检材取样及确证实验

送检的内裤布片为单层、幅面较宽, 可排除其为内裤裆部区域。肉眼观察未发现其上有明显斑迹, 随机剪取2处布片（大小均为1.0 cm× 1.0 cm左右）并分别装入1.5 mL离心管, 加入双蒸水200 μ L, 室温静置30 min, 按行标GA/T 766-2020《人精液PSA检测金标试剂条法》进行确证实验。

1.2.2 样本编号及DNA检验

将上述2份检材采用差异裂解法处理, 第一次孵育完毕, 高速离心后收集其上清液（编号为W1-1-F、W1-2-F）使用全自动24道微量DNA提取工作站（宁波市博坤生物科技有限公司）提取DNA, 沉淀（编号为W1-1-C、W1-2-C）及消化后的布片载体（编号为W1-1-Z、W1-2-Z）继续进行孵育裂解, 获得的DNA消化液与死者血样（编号为R1）均使用前述自动工作站提取DNA。以VersaPlex^TM 27PY System及Yfiler^TMPlus试剂盒进行PCR扩增, 扩增产物均采用3500XL基因分析仪电泳。所得全部数据采用GeneMapper^TM ID-X软件进行分析。

1.3.1 检材复核取样及确证实验

根据首次检验数据分析判断的情况, 补充采集死者母亲的样本进行比对, 并对内裤布片作复核检验。本次取样依然为盲取, 剪取的布片大小与首次剪取相仿, 但选择的2处取样部位尽量远离第一次取样部位。将剪取的布片先取适量, 采用酸性品红亚甲基蓝染色法染色涂片后显微镜（10× 40倍）下观察是否附着有精子细胞。

1.3.2 样本编号及DNA复核检验

本次剪取的2份检材在采用差异裂解法时将消化时间延长至过夜, 收集到的上清液（编号为W1-3-F、W1-4-F）、沉淀（编号为W1-3-C、W1-4-C）及消化后的布片载体（编号为W1-3-Z、W1-4-Z）采用与1.2.2中相同的步骤提取DNA。死者母亲比对样本采用Chelex-100法提取DNA。

上述提取的DNA样本及死者DNA样本采用PowerPlex^® Fusion6C试剂盒进行PCR复合扩增, 死者母亲样本采用VersaPlex^TM 27PY System进行PCR复合扩增, 电泳及数据分析均与1.2.2中相同。

首次检验剪取的两份检材PSA试剂条检验结果均呈阴性。复核检验剪取的另两份检材在显微镜下均观察到在布片纤维上附着有粉染的精子头。

经过两轮取样检验, 内裤布片差异裂解收集的上清液及沉淀均未获得STR数据, 消化后的布片载体（编号为W1-1-Z、W1-2-Z、W1-3-Z、W1-4-Z）均获得同一个男性的DNA分型。其中W1-1-Z样本在大片段有个别基因座未检出基因分型; W1-2-Z样本在Penta E基因座的分型为10/12, 峰值较低, RFU值仅约为500; W1-3-Z样本、W1-4-Z样本在Penta E基因座基因分型均为10/18, RFU值在3 000~3 500。死者血样经过两次检验及平行扩增, CSF1PO基因座的基因分型均为12。表1为内裤布片（W1-4-Z）、死者血样及死者母亲样本的检验结果。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 常染色体STR相关数据 Table 1 Autosomal STR data from the tested materials 基因座 内裤布片 死者 死者母亲 死者哥哥 D3S1358 17/18 17/18 15/18 17/18 D1S1656 13/14 13 13/15 / D2S441 11/12 10/11 10 / D10S1248 13 13 13 / D13S317 8/10 8/11 9/11 8/11 Penta E 10/18 10/12 5/12 5/18 D16S539 9/13 9/10 10/11 11/13 D18S51 14/17 14 14/21 14/17 D2S1338 18/22 18/20 18/20 18/22 CSF1PO 10/13 12 9/12 12/13 Penta D 9/12 9/12 11/12 11/12 TH01 9 9 6/9 9 vWA 16/18 16 16 16 D21S11 31/33.2 29/31 29/31.2 31/31.2 D7S820 12 11/12 11/12 12 D5S818 12/13 12 11/12 12 TPOX 8/11 8 8 8/11 D8S1179 10/13 10/13 10/14 13/14 D12S391 18/19 18/20 20 / D19S433 13/16 13/16 13/14 13/14 D6S1043 11/14 14/18 18/19 / D22S1045 11 11/17 15/17 / FGA 23/24 23 23/24 23/24 Amel X/Y X X X/Y

表1 常染色体STR相关数据 Table 1 Autosomal STR data from the tested materials

消化后的布片载体上所获得的Y-STR基因型显示与办案单位提供的死者哥哥的基因型（Yfiler^TM试剂盒）在17个基因座上相同。

根据死者样本、死者哥哥样本（办案单位提供的17个基因座分型结果）、死者母亲样本与内裤布片检材所获得的常染色体STR分型, 按照行标GA/T 965-2011《法庭科学DNA亲子鉴定规范》中不符合遗传规律及标准三联体计算公式, 所得父权指数均可达10⁷以上, 从遗传学角度支持内裤布片上测得的男性个体物质源自于死者及其哥哥的生物学父亲。

无论是传统的还是改良的差异裂解法, 在检验精子DNA时, 都是去除载体后收集消化后的悬浮液^{[8, 9, 10]}。本案的内裤布片在两次差异裂解收集的沉淀中均未检出男性DNA物质, 这可能与该检材在室温放置了18年之久, 且当时因揉绞搓洗, 精子细胞经转移而牢固附着于物证载体上不能有效分离下来有关。本案的成功检验, 提示陈旧性精斑检材在采用差异裂解法时不能放弃对剩余载体同步提取DNA。

陈旧性生物检材的另一显著特点就是DNA会存在不同程度的降解。本案中死者血样、内裤布片所获得的STR分型均呈现出小片段基因座峰值高、大片段基因座峰值低的倒三角降解特征。一般在分析此类大片段基因座的STR分型时较多地关注纯合子的准确性, 而对于杂合子分型容易忽视。死者血样在CSF1PO基因座的分型为12, 且峰值较低; 通过不同试剂盒的复核检验后仍为12。内裤布片在Penta E基因座的STR分型为10/12, 在初始分析中, 由于没有出现其他杂峰, 就只认为是因扩增片段太长导致的峰值较低所致, 对数据的准确性并没有作过多考虑。但根据前期所得到的比对数据进行深入判断时, 才意识到该基因座分型可能有误。经过复核检验, 确认该基因座的正确分型为10/18。因此针对陈旧性样本, 在进行DNA检验时, 建议留备份检材或备份DNA模板进行复核检验, 并最好采用不同的扩增试剂盒测试, 以期获得准确的DNA分型结果。否则, 可能会对STR数据的深入分析及案件的侦查方向产生误导。

根据上述DNA检验结果, 结合调查访问, 认为内裤布片上的精斑为精子细胞的二次转移所致。依据在于：

1）通过显微镜观察, 确认布片纤维上附着有精子细胞。因为DNA提取过程中采用了差异裂解法去除了上皮细胞, 而内裤布片经差异裂解收集的上清液及沉淀又均未获得STR数据, 表明本案所获得的男性STR分型应来源于附着在纤维上的精子细胞。

2）检验结果支持精子供者为死者及其哥哥的生物学父亲, 但通过对死者家属及周围证人当时的询问调查, 其父无作案时间, 因此该精斑不可能为在案发现场直接遗留于死者内裤布片上。

3）通过深入询问了解, 死者内裤是与其母亲的内裤混在一起由其母亲洗涤, 而死者父母亲在当时具有正常的夫妻性生活, 因此死者母亲内裤上附着的死者父亲的精斑就有机会经由洗涤途径转移到死者内裤上。国外学者通过实验也证实精子细胞通过洗涤可转移至其他衣物纤维上并能提供完整的DNA分型^{[11, 12]}。

在洗涤过程中, 精子细胞及精浆等其他成分与最初附着的载体分离而悬浮及分散于洗涤液中, 此洗涤液就作为中间介质而使精子细胞从一个物品转移到另一个物品上。因此, 通过洗涤方式发生二次转移的精子细胞有以下几个表征：

1）精子细胞呈散在性分布。有研究表明洗涤后的衣物上虽然看不到血斑, 但通过分子生物学分析可获得供者的完整DNA分型^[13]。本文的实验结果也证明了这一点。本案中的内裤布片上肉眼观察不到明显的斑迹, 检验的4处布片均为盲取且部位比较分散, 但均检出相同的结果。这说明二次转移的精子细胞在检材载体上为散在性分布。

2）精子细胞独立存在。精液中含有的其他蛋白类物质会在洗涤液中分散悬浮或溶解, 单位体积内的含量就急剧下降。而洗涤剂中所含有的表面活性剂或酶会导致前列腺特异性抗原、酸性磷酸酶等成分发生变性或分解, 从而导致精斑预实验或PSA检验等结果为阴性, 但通过精子染色法可观察到独立存在的粉染的精子头。

3）与载体结合较为牢固。本案中的布片在差异裂解过程中经过长达24 h的振荡孵育, 精子细胞仍然附着于布片纤维上, 说明转移的精子细胞与载体的粘附较为牢固, 这可能与手工洗涤过程中内裤之间互相揉绞搓洗有关, 而未粘附或粘附不牢固的细胞则会经洗涤去除掉。

4）转移后的细胞数量较少。根据显微镜下观察到的精子数量以及DNA图谱RFU值, 推断在洗涤过程中只有少量精子细胞发生了二次转移。

精斑类检材是法医物证检验中常见的类型, 确证试验及DNA个体识别可作为法医学中涉及性侵行为的定案依据。本案中在死者内裤布片上检出精子且获得完整的DNA分型, 若未进行深入研判分析, 极有可能会认为是犯罪嫌疑人所遗留, 从而给侦查人员提供错误的侦查线索。因此, 本案对法医DNA检验工作者可有以下几点提示：

1）在生物检材的DNA检验中, 应加强与现场勘查及侦查人员的信息沟通, 必要时可参与访问, 尽可能多了解、多掌握一些有关案件情况的细节。本案中通过与死者母亲的几次细致对话, 了解到当地当时衣物洗涤的一些习惯及死者父母性生活的细节, 为认定内裤布片上的精子细胞为二次转移提供了可靠的判断基础。

2）每一个生物检材在得到DNA的STR数据后, 首先应判定数据的准确性, 对一些不可靠的基因座分型结果应及时进行复核。其次在排除外源性污染的前提下, 还应进行关联性分析及证据评估, 有时就需要考虑DNA二次转移的问题。本案中当发现内裤布片上的精子Y-STR分型与死者哥哥一致时, 对该样本常染色体STR分型与死者及其哥哥同其母亲进行亲缘关系的进一步分析, 结果支持该内裤布片上的精子供者为死者及其哥哥的生物学父亲。这一结果使笔者意识到该DNA数据并非真正的嫌疑人所留, 从而避免了该案出现侦查方向上的偏离。因此在没有明显斑迹的布片上检出的精斑分型, 在结果解释上应更为谨慎, 因其也许并不是嫌疑人所留, 可能只是洗涤后遗留在衣物上的正常性伴侣的物质抑或是与案件无关人员的物质经洗涤导致二次转移。

3）对涉及性侵行为的体外生物检材的混合斑DNA检验, 规范性操作步骤及拓展检验比如确证实验及上清液的DNA检验都非常重要, 这些结果不仅可指导复核检验的方案制定, 而且对生物检材的DNA检验结果的解读也具有指向作用。本案中内裤布片上检见精子, 差异裂解收集的上清液及沉淀均未检出DNA分型, 正是这一不寻常的结果, 引起了对该检材进行复核检验及深入分析。

4）本案中内裤布片上精子被判定为细胞的二次转移所致, 因而使其失去了证明性侵行为的价值, 但此发现同时又为法医DNA生物检材的查找拓展了新的思路, 在某些涉及性侵的案件中, 可通过检验与受害者衣物共同洗涤过的载体上发现的精子细胞及DNA来获得关于犯罪嫌疑人的侦查线索。