差异裂解法（different extraction）或称两步消化法（two-step lysis）, 于1985年由Gill等^[3]提出。该方法利用精子细胞与阴道上皮细胞核表面的差异, 将精阴混合斑检材分两步消化, 从而获取纯的精子细胞DNA ^[4]。该法成本低、操作简单, 至今仍是国内外大部分鉴定机构及实验室分离精阴混合斑的主要方法。然而, 常规的差异裂解法分离效率较低, 对于某些微量、陈旧性的检材或精阴混合斑中精子细胞含量相对较少的检材, 常会造成消化不完全或过度消化的情况, 使精子细胞DNA损失, 导致STR分型失败。

近年来, 许多研究者就其分离效率低等因素, 对差异裂解法不断进行了改良。2014年, Lounsbury 等^[5]通过改变第一次温育时缓冲液的条件（增加缓冲液pH等）, 提升了精子细胞回收率; 2017年, 马骏等^[6]提出并建立尼龙膜套管技术, 根据精阴细胞物理性状差异以及分子筛的原理, 将差异裂解法中第一次消化后所得的混合液利用尼龙膜套管分离精子细胞, 该技术所需尼龙膜套管价格相对便宜, 实验操作简单, 耗时短, 可将精阴混合斑中精子细胞和女性上皮细胞有效分离, 减少了精子细胞的损失, 特别适用于男女物质比例悬殊、常规差异裂解法难以消化完全的精阴混合斑, 有很好的应用价值; 2018年, Timken等^[7]在原有基础上增加“ 试管转移” 步骤, 即将重新悬浮的精子沉淀移至新试管中, 再进行第二次温和裂解和随后的洗涤, 大大提升了精子细胞的DNA纯度; 2020年, 赵凯等^[8]发现在差异裂解法中利用硅珠提取方法, 能获得良好的灵敏度及抗抑制能力, 效果优于免疫磁珠法, 并可广泛适用于各种法医检材; 2020年, Kim等^[9]使用苏木精（0.03%, 体积分数）对精子细胞染色, 通过差异提取过程观察染色的细胞, 减少了多个洗涤步骤导致的精细胞损失; 2020年, 何佳烘等^[10]报道, 在前期处理混合斑时增加纯化和二次消化步骤, 对于混有女性阴道血或男女物质比例悬殊的检材, 除去女性血液成分后, 经洗涤可使细胞碎片与精子沉淀分开, 能减少精阴混合斑中精子的损失, 大大增加精子细胞分离的成功率。

为使差异裂解法标准规范化, 节省人力并避免与含有SDS等毒性有机物的消化液直接接触, 不少研究者利用机器人等技术对差异裂解法做出改进以实现自动化：2019年, Timken等^[11]通过使用Hamilton AutoLys STAR系统对差异裂解法实现自动化, 该系统配备有方法所需的温育、振荡和离心等步骤的相关组件, 能实现上述步骤的完全自动化, 经与手动操作对比, 证明该法具有可行性; 2020年, Goldstein等^[12]通过QIAcube自动样品制备系统实现了差异裂解法的自动化, 降低了下游混合物的干扰, 提高了STR配置文件的质量, 显著减少了动手时间。

1.2.1 激光捕获显微切割技术

激光捕获显微切割技术（laser capture microdissection, LCM）是一种可以分离单个细胞的技术, 能够实现对不同形态细胞的分离检验。单纯LCM通过在组织切片上覆盖一层透明的热塑膜, 根据精阴细胞的形态差异, 利用激光经显微镜直观自动地从检材中捕获单细胞亚群或单个细胞^[13], 从而实现精阴混合斑的分离检验。该技术针对性极强, 能从复杂的精阴混合斑检材中快速、准确地获得微量的精子细胞, 较传统的差异裂解法在洗脱过程中损失掉的精子细胞更少^[14]。但是对于男女物质比例悬殊或精子细胞形态难以辨认的陈旧性检材^[15], 无法准确地分离出精子细胞。此外, 由于LCM对设备要求较高, 其也不便于在基层大规模普及。

2011年, Axler-DiPerte等^[16]将LCM与免疫荧光染色技术结合进行精子细胞分离, 通过将荧光染料核固定并与针对精子细胞的特异性抗体偶联, 对混合斑中的精子细胞进行HYLiter^TM免疫荧光染色后, 在直观显微镜下辨认染色后的精子细胞并标记; 2014年, 杨帆等^[17]把LCM与FISH相结合, 利用X、Y染色体相对应的特异性荧光探针, 将X、Y染色体分别染成红色和绿色, 在观察荧光信号时, 先使用蓝色荧光使细胞核轮廓清晰可见, 定位后再调至红绿色荧光, 能够快速定位细胞的位置。上述两种方法, 均适用荧光标记定位细胞位置, 可以达到分离细胞的目的, 能大大提高细胞的识别效率, 且FISH能清晰地分辨阴道上皮细胞和精子细胞, 便于精子细胞的识别, 而对于精子细胞形态不规则的检材, 这种方法的优势就更明显。

1.2.2 显微操作法

显微操作法更多运用于生殖医学领域, Findlay等^[18]于1997年首次利用显微操作法实现单细胞的分离检验。该技术通过显微操作仪, 在不同倍镜下调节吸吐旋钮, 利用显微操作仪吸针将悬液中的精子细胞转移至扩增液面, 并对精子细胞准确计数^[19], 从而可成功地从精阴混合斑中分离出精子细胞。该法优点在于可直接获取精阴混合斑中的精子细胞, 减少模板损失, 提高分型成功率, 节省检材, 对精阴混合斑中微量精子的检验效果较好。2011年, 黄江平等^[20]采用单细胞显微捕获联合低体积扩增技术, 很好地分离了混合上皮细胞, 有效解决了混合上皮细胞的分型问题; 此外, 由于低体积扩增体系的体积减小, 节省了试剂, 半球状的密闭空间提供了最佳的微反应环境, 也提高了PCR反应的灵敏度。但是该法仪器设备要求高, 检验速度慢, 对人员操作能力要求高, 且单一精子DNA检验会出现随机扩增问题, 影响准确性, 需要多次重复操作进行综合研判。

微流控芯片技术（microfluidic chip）是把生物学、化学等实验操作过程集成到一块芯片上, 该芯片内部至少要有一尺度为微米甚至纳米的结构, 能够自动完成实验及分析的全过程^[21]。细胞捕获或分离区域和反应检测区是芯片的主要功能区, 同时也是不同微型芯片的关键和特色区域^[21], 可满足不同的需求。该技术通过将精阴细胞混合液注射至微型芯片中, 在特定区域根据不同的功能及特点, 将细胞混合液中的精子细胞进行分离。该法优点在于其上样体积小、检测结果单个周期短, 能够有效节省检材与试剂, 可快速检测, 耗时少。同时, 该法适用于自动化检测并能实现精子细胞的微观操控和精确分析。

2009年, Norris等^[22]根据声波差异提取的原理, 通过微流控芯片技术实现精阴细胞的分离, 创立了声波差异提取法。2015年, Liu等^[23]基于精阴细胞的大小及流体动力学上的差异制造了一种微型芯片, 大大提高了精子细胞DNA的分离效率。2018年, Inci 等^[24]利用微流控与Sialyl-LewisX寡糖序列结合, 将精子细胞DNA的分离测定时间从原先的8 h减少到8 min, 大大提高了精子分离的捕获效率。2020年, Deshmukh等^[25]将微流控芯片与手机成像系统相结合, 通过精阴细胞之间的形态差异, 利用代码, 实现二者分离, 以期达到精子细胞DNA提取的目的。此外, 还有研究者以微流控芯片为基础, 利用精阴细胞导电性及形状不同, 通过双向电泳^[26]的方法分离出精阴混合斑中的精子细胞。但是, 微流控芯片技术是一项新兴技术, 其芯片的集成化、商品化程度还不高, 技术也有待完善可靠, 现尚没有成熟的芯片产品面世。

该方法根据精阴细胞形态学大小差异即阴道上皮细胞直径（40~60 μ m）远大于精子细胞直径（约6 μ m）, 将精阴混合液通过不同孔径的过滤网多次过滤, 从而分离出精阴混合斑中的精子细胞。其利用成熟的过滤技术对精阴混合斑中的精子细胞进行分离富集, 较差异裂解法分离速度快、操作简单、经验要求不高、可实现精阴混合斑的快速分离检验。但是目前仍仅适用于常量的精阴混合斑检材。

2018年, 朱典等^[27]通过对其发明的一种人体脱落上皮细胞滤器^[28]作改良, 利用不同孔径的尼龙网格膜制作滤网, 采用二重过滤的方法, 快速分离并检验精子细胞, 在数起案件检验中取得了良好的效果, 具有一定的实际应用价值。

磁性分离技术其工业应用已有很长的历史。1979年Ugelstad等首次将该技术应用于生物医药领域。近年来该技术也开始运用于法医精阴混合斑中精子细胞的分离^[29], 该技术通过制备与精子细胞表面特异性抗原相对应的抗体, 偶联磁珠形成免疫磁珠, 再使其与混合检材中的精子细胞形成磁珠-抗体-精子细胞复合物, 在外加磁场作用下就可实现定向捕获并分离出精子细胞。

精子细胞的表面特异性抗原种类较多。2002年, Eisenberg等^[30]根据精子细胞表面的3种特异性抗原制备免疫磁珠, 成功分离出了精阴混合斑中的精子细胞; 2007年, Anslinger等^[31]筛选出3种抗血管紧张素转换酶抗体并制备成免疫磁珠, 实现了精阴混合斑中精子细胞的分离, 扩大了免疫磁珠的选择范围; 2011年, 赵兴春等^[32]利用抗人精子鱼精蛋白抗体和抗-SPAG8抗体构建免疫磁珠, 制作特异性定向捕获复合体, 实现了精子细胞定向富集和分离, 初步建立了捕获试剂体系; 2015年, 李学博等^[33]发现MOSPD3抗体、SPAG8抗体均可以运用于免疫磁珠技术特异性分离精阴混合斑中的精子细胞。此外, 在一些轮奸案件中, 常会混合多名男性的精子细胞。有学者发现不同血型男性的精子细胞表面会有不同的ABO特异性抗原, 据此选择与之相对应的特异性抗原, 采用免疫磁珠法分离精子细胞的同时, 可对不同男性的精子细胞进行分离。2016年, Xu等^[34]通过将免疫磁珠法和流式细胞术相结合, 成功地将两名不同ABO血型的嫌疑人的精子细胞DNA分离。该类抗原的发现, 为日后从精阴混合斑鉴定出两名及以上男性精子DNA提供了借鉴。目前, 发现的精子特异性抗原已达100多种, 制备免疫磁珠的方法也有多种, 这些将有利于该技术的方法学研究和优化^[33]。

免疫磁珠技术的优点在于操作简单, 分离快速, 使用安全, 所需实验器材和仪器价格相对便宜, 可在基层鉴定机构和公安局普及。对于多人实施的性犯罪, 该技术可利用不同ABO血型的男性精子细胞表面特异性抗原的差异, 查明精阴混合斑中不同血型的男性成分来源。此外, 该方法基本不会对精子细胞本身造成破坏, 并可同时进行精子细胞的分离、纯化与富集, 具有自动化检验的发展前景。其缺点在于需要对特异性抗体进行筛选, 且对于某些案件, 若检材较为陈旧、精子细胞表面抗原降解, 则很难实现免疫磁珠与精子细胞的结合, 此时就需要结合实际情况, 借助或运用其他技术完成精子细胞的分离。

流式细胞术（flow cytometry, FCM）或称荧光激活细胞分类术（fluorescence-activated cell sorter, FACS）, 是一种以流式细胞仪为核心, 可对快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速定性、定量分析或分选的技术。

该技术经对精阴细胞混合液中的精子细胞进行免疫荧光标记, 制成单细胞悬液, 通过流动室液流系统、光源与光学系统、信号收集与转换系统可分别对精子细胞实现样品聚集、产生光信号并转为电信号。电信号再通过计算机与分析系统就能逐个、多参数、快速地对细胞进行定性、定量分析。而后细胞经过分选区, 利用细胞膜表面不同的电荷量, 通过分选系统施加的高压电场, 就可完成对细胞的分离^[35]。

Schoell等^[36]通过主要组织相容性复合体I类分子（MHC I）、细胞角蛋白和CD45分子在精阴细胞表面的差异性表达等特点, 采用流式细胞荧光分选技术经逆向筛选实现了精阴细胞分离^[37]。但对陈旧、干燥、降解严重的检材, 该方法会因为细胞膜表面蛋白的缺失而失效。因此有研究者指出, 可将物证提取方法由阴道拭子改为阴道灌洗, 以减少转移过程中对精子细胞的损伤, 提高分离成功率。

FCM可通过计算机自动实现对精子细胞多参数的快速定性、定量分析和分选。但是对于精子细胞含量极低的检材以及精子细胞难以辨认的陈旧性检材, 其与LCM有相同的局限性; 再者其也要求检验者应具有较高的经验与技术水平。此外, 流式细胞仪费用较高, 难以在基层推广。

上述6种精阴混合斑细胞的分离技术与方法各自的技术特点和使用条件概括于表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 本文所述精阴混合斑细胞分离方法比较 Table 1 Comparison among methods to separate sperm cells from mixed stains of seminal and vaginal fluid 技术特点和使用条件 差异裂解法 显微捕获法 微流控芯片技术 孔径过滤法 免疫磁珠法 流式细胞术 LCM 显微操作法 应用形态学差异 - √ √ - √ - - 应用膜表面特异性结构 √ - - - √ √ 免疫学应用 - √ - - - √ √ 微量检材 受限 受限 √ - - 受限 受限 陈旧性检材 受限 受限 - - - - 受限 检测速度 慢 快 慢 快 快 快 快 操作技术含量 - 高 高 - 低 低 - 设备要求 - 高 高 高 - - 高 成本 低廉 - - - - 低廉 - 分离率 低 高 高 高 高 高 高

表1 本文所述精阴混合斑细胞分离方法比较 Table 1 Comparison among methods to separate sperm cells from mixed stains of seminal and vaginal fluid

在对精阴混合斑进行细胞分离后, 能够得到单一来源的精子细胞。在提取其DNA后, 利用DNA多态性分型技术（目前多采用PCR-STR分型技术^[4]）, 通过检测其DNA多态性, 可以实现对该精子细胞的个体识别。由于精子细胞为单倍型, 仅分析一个精子细胞无法获得个人的完整基因型, 故一般需要捕获7个以上细胞才能获得个体的完整分型（> 99%）, 而每个捕获样本还需至少平行检验两次以上, 以保证每个精子细胞均能获得准确的分型。

此外, 由于Y染色体为男性特有, Y-STR呈男性伴性遗传, 除突变外, 父系所有亲属都具有相同的Y-STR单倍型, 因此可以利用父系亲属的参考样本对犯罪嫌疑人进行排除或追踪。然而, 其用于个人识别仅具有排除意义, 不能认定同一。

基因组中特定区域的甲基化特征具有细胞或组织特异性, 精斑中的DNA也有其自身特异的甲基化特征。依据DNA甲基化位点构建精液特异性SNP分型复合体系可以特异性地获得精子SNP位点的分型, 对于精液的鉴定具有重要价值。但该体系距离实用尚需时日, 有关问题如通过管家基因的分型结果来判断阴性结果的样本中是否含有生物检材, 进行种属确证实验验证是否具有人种属的特异性, 以及分析更多体液相关的甲基化位点数据, 补充更多的精液特异性位点使分型更加准确等^[38], 仍需要做大量的工作。

大多数情况下, 对强奸案件相关物证检验时, 精阴混合斑中女性物质DNA的检测及其数据库检索往往被忽视^[39]。然而在一些情况下, “ 被害人” 会出于某种目的而提供假证。因此在强奸案件中, 女性物质的认定也是有关物证可作为证据的前提条件, 只有确认了其与被害人相关, 检出的精斑才有意义, 并且对案件定性还会起到至关重要的作用。

法医实践中, 常从差异裂解法第一次消化后离心的上清液中提取混合斑女性DNA成分, 并对常染色体进行STR多态性分析以实现对女性成分的个人识别。

虽然随着技术革新, 前文所述各种精阴混合斑分离方法一直在不断改善, 精子细胞的分离率也在不断提高, 但是大多数情况下, 检材中男女比例悬殊, 加之部分精阴混合斑附着载体具有较强的粘附性, 最后还是无法得到单一来源的DNA。男性和女性个体在不同遗传标记系统中存在差异, 可根据DNA混合图谱中的峰高和峰面积来推测男性个体的数目及在混合斑中的比例, 因此, 可以通过检测这些遗传标记来达到区分判断精阴混合DNA分型的目的。该方法是通过使用男女不同的遗传标记、分型方法以及分析方法, 对精阴混合斑的DNA混合物进行分析, 以确定其来源及个体数, 为案情提供信息。目前使用到的遗传标记有短串联重复序列（STR）、单核苷酸多态性（SNP）、微单倍型（MH）等。

2.4.1 短串联重复序列（STR）

在法医DNA分析中, 多应用常染色体STR和Y染色体STR进行DNA分析, 其中Y-STR在性犯罪案件中应用已非常成熟, 近年来新的Y-STR不断出现, 使得其数量愈加庞大, 且在不同人种差异鉴别上也显现出独特优势^[40]。当前, 常用染色体STR标记在法医DNA分析中应用最为广泛的是复合扩增法和毛细管电泳法（CE）。近年来, 二代测序技术也有应用, 而且较传统的毛细管电泳STR分型技术, 该技术既能检测STR基因座的长度多态性信息, 又能分析各基因座序列多态性信息, 通过分析核心序列和侧翼序列的碱基序列差异, 可对等位基因进行精准分型, 故在法医物证领域发挥着越来越重要的作用^[41]。当前, STR-CE分型的个体识别框架已建立较完备, STR也是当今法医DNA分析的主流。在刑事侦查中, 法医可将犯罪现场获得的STR与数据库中的进行比对, 如有匹配, 就将利于调查进一步进行^[40]。

STR标记仍有一定的局限性, 其虽然可以很好地分析两个人的DNA混合物, 但是不适合于复杂的混合物分析, 且混合物中目标DNA至少要占DNA总量的5%~10%时才能做出分析, 否则就会出现随机扩增效应、随机抽样变异等导致片段丢失。此外, STR标记也不能很好地适用于降解DNA的分析。

近年来, 有不少研究者在对STR标记方法进行改良：

1）将其他类型的遗传标记与STR相结合, 如SNP-STR、DIP-STR等, 以求极大程度地在不平衡混合DNA中靶向检测出次要成分DNA, 例如在2018年, Tan等^[42]使用11种新的SNP-STR标记, 通过ARMS进行基因分型, 实现了次要贡献者的DNA在1∶ 100的混合样本中得到成功分型。

2）DNA混合物的定量分析解释, 可以分析2人以上、5人以下的DNA混合物, 当前主要有半连续（定性）模型和全连续（定量）模型两种方法, 其中, 半连续模型仅能利用定性信息, 而连续模型能够充分利用包括定性信息的分型结果。2011年, 第一个连续软件TrueAlleleÒ 获得验证, 并随后在英国和美国的法院得到应用, 其他如STRmixÔ 的连续软件, 也有验证和应用^[40]。2016年, 第一个开源连续模型软件EuroForMix发布。然而通过实验研究与实践应用发现, 全连续模型不能解决复杂混合物中存在的少量DNA问题, 且与半连续模型相比, 连续模型的算法和计算相当复杂, 在法庭上更难讨论, 不同连续软件的LR一致性要低于半连续软件。

在我国, 前期研究主要集中在前期投入少而经验要求相对较高的人工分析领域, 相比于较早开始DNA检验的国外, 国内从理论模型研究到系统平台搭建都还不成熟, 在自动化和智能算法方面国外仍有很多可借鉴之处^[43]。在不久的将来, 随着人工智能技术的不断发展, STR分型技术将会趋向自动化, 可有效扩大应用范围并降低使用门槛, 会有助于从根本上解决混合斑STR分型分析应用的难题。

2.4.2 单核苷酸多态性（SNP）

当前SNP标记已运用于法医学领域, 虽然较STR而言, SNP的多态性低, 无法获得与STR相同的信息量, 这也是SNP的主要限制, 但是其更适合于短扩增片段的降解DNA或灾难受害者识别, 且其突变率较低。此外, SNP标记较STR有更多的法医学应用前景。

近年来, 一些科学家提出了一种利用数千个双SNP来分析复杂混合物的策略, 而不是追求每个SNP的高杂合子。2011年, Voskoboinik和Darvasi^[44]应用一种随机人不排队（random man not excluded, RMNE）的方法, 基于数千个双SNP分析复杂混合物的策略, 提出了p（RMNE）的算法：

式中：S是排除位点或错配位点的数目, p（Ai）是位点i的主等位基因频率。p（RMNE）越小, 被怀疑是混合物贡献者的机会越小。一般来说, p（RMNE）< 10^-9。

有学者提出, 可以通过增加SNP的位点数量来提高DNA混合物的鉴别力, 但是此举会暴露个体过多的DNA信息, 造成侵犯隐私。但无论如何, 其在降解DNA分析方面的优势是无可争议的, 随着检测与测序技术的成熟, 其有潜力服务于各种法医学目 的^[40]。

2.4.3 微单倍型（MH）

MH作为一种新引入的遗传标记, 已成为法医学领域的研究热点。其最早由Kidd等^[45]于2013年提出, 为在小于300 bp的DNA区段内、包含2个SNP的多态性位点。在300 bp DNA片段长度范围内, 微单倍型内部SNP间的重组率几乎为0。一个微单倍型位点可视作一个独立基因库, 其多态性由SNP的特定组合所构成^[46]。

MH标记的特点在于其突变率低, 长度短, 更适合于降解DNA的分析, 在突破STR标记局限性的同时, 又承载有SNP标记的所有优点, 且能较大程度地发挥测序技术在法医学分析中的优势。此外, MH标记通过定义几个链接SNP作为一个单一的位点, 可以减少无用信息DNA片段的测序, 避免侵犯隐私。然而, 由于作为一种新引入的遗传标记, MH标记的群体遗传数据相对缺乏, 检测成本也相对较高, 另外, 位点筛选条件也还有待提高。但值得肯定的是, MH标记将会是一个非常有前途和通用性的工具, 在未来, 将会被更广泛地运用于精阴混合斑分析以及其他法医学应用。