引用本文
孙立敏, 王松才, 朱焕慧, 林贤文, 管旭, 谭莉. 在线固相萃取-液质联用法同时检测血液样品中12种芬太尼类药物[J].刑事技术, 2022,47(2):121-127
SUN Limin, WANG Songcai, ZHU Huanhui, LIN Xianwen, GUAN Xu, TAN Li. Integral SPE-LC-MS/MS to Simultaneously Determine 12 Fentanyl-kind Drugs in Blood[J]. Forensic Science and Technology,2022,47(2): 121-127  
Doi: 10.16467/j.1008-3650.2021.0167
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在线固相萃取-液质联用法同时检测血液样品中12种芬太尼类药物
孙立敏, 王松才, 朱焕慧, 林贤文, 管旭, 谭莉
广州市刑事科学技术研究所,广州 510030

第一作者简介：孙立敏,男,河南南阳人,硕士,高级工程师,研究方向为理化检验。E-mail:sallim@126.com

收稿日期: 2021-05-24 修回日期: 2021-11-16
基金资助: 广州市民生科技攻关重大专项（2019030009）
摘要

目的 采用在线固相萃取-液质联用（in-connection SPE-LC-MS/MS）技术,建立血液样品中12种芬太尼类药物的同时检测方法,为刑事案件血液中12种芬太尼类药物的检验鉴定提供依据。方法 血液样品用乙腈沉淀蛋白,经离心、稀释、过滤后上样,采用Agilent PLRP-S（15~20µm,2.1mm×12.5mm）在线SPE柱富集纯化,以Agilent Poroshell 120 EC-C18（3.0mm×150mm,2.7µm）为分析柱,用5mmol/L醋酸铵缓冲液（含0.1%甲酸）-乙腈为流动相进行梯度洗脱,采用电喷雾离子源（ESI）、多反应监测（MRM）对12种芬太尼类药物进行检测。结果 实验优化了色谱条件、质谱条件、在线SPE上样流速、流动相种类、六通阀切换时间、样品有机溶剂比例等参数,经验证,在实验浓度范围内,12种芬太尼类药物线性关系良好, R2均大于0.9990,方法检出限为0.2~0.4ng/mL,定量限为0.7~1.4ng/mL,回收率为83.1%~131.1%,日内精密度和日间精密度分别为1.0%~25.6%、2.1%~30.5%（ n=6）。结论 本实验建立的血液样品中的12种芬太尼类药物同时检测方法,具有操作简单方便、灵敏度高、样品需求量少、检出限低等特点,适合于血液样品中芬太尼类药物的检测分析。

关键词: 毒物分析; 在线固相萃取; 液质联用; 芬太尼
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2022)02-0121-07
Integral SPE-LC-MS/MS to Simultaneously Determine 12 Fentanyl-kind Drugs in Blood
SUN Limin, WANG Songcai, ZHU Huanhui, LIN Xianwen, GUAN Xu, TAN Li
Guangzhou Institute of Forensic Science, Guangzhou 510030, China
Abstract

Objective To establish a method for simultaneous determination of 12 fentanyl-kind drugs in blood through integral SPE-LC-MS/MS with purpose to provide reference for identification of relevant cases.Methods The blood samples (harboring the 12 fentanyl-kind drugs) were treated with acetonitrile for proteins to precipitate, successively centrifugated to collect the supernatant that was subjected to dilution and filtration. The filtrate was directly undergone into integral SPE-LC-MS/MS processing so that Agilent PLRP-S (15-20µm, 2.1mm×12.5mm) column had played its role to enrich and purify the injected filtrate and Agilent Poroshell 120 EC-C18 (3.0mm×150mm, 2.7µm) column to perform its chromatographic separation under the gradient elution of mobile phases of A (5mmol/L ammonium acetate plus 0.1% formic acid) and B (acetonitrile). The analytes were detected in multiple reaction monitoring (MRM) mode through the electrospray positive ionization (ESI+).Results Under the optimization of chromatographic condition, mass spectral setting, sampling flow, mobile phase, valve swithching programs and organic solvent ratio, the 12 fentanyl-kind drugs showed good linear relationship within the tested concentration ranges, revealing their coefficients of determination as R2>0.9990. The method was present of detection limits and quantification limits being 0.2-0.4ng/mL and 0.7-1.4ng/mL, demonstrating the recoveries at three levels being fallen into 83.1%-131.1%, intra-and inter-day RSDs being the respective 1.0%-25.6% and 2.1%-30.5% ( n=6).Conclusions The method established here is simple and efficient, demonstrating its excellence of low quantity of required sample, high sensitivity and low detection limit, suitable for simultaneous determination of 12 fentanyl-kind drugs in blood.

Key words: toxicological analysis; in-connection SPE; LC-MS/MS; fentanyl

近年来, 芬太尼类新型毒品作为一类新精神活性物质在全世界范围内有滥用趋势, 尤其在欧美国家[1]。芬太尼类新型毒品属阿片类镇痛药物, 其镇痛作用与吗啡类似, 但镇痛效果比吗啡强几百上千倍, 甚至上万倍[2], 滥用后会出现吸毒快感、呼吸抑制、心动过缓等副作用, 少量服食即可致人死亡。查阅文献, 对芬太尼类的检测, 主要集中在血液、尿液、毛发、唾液、呼气、废水、芬太尼固体粉末[2]、芬太尼制毒原料[3]等样品中; 常见的样品前处理方法主要有固相萃取法（SPE）、液-液萃取法[4]等, 其中SPE法是生物样品中芬太尼类物质提取和富集最常用的前处理方法[2]; 常见的分析检测技术主要为分光光度法、免疫分析法、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（UPLC）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）等[2], 其中LC-MS联用技术多采用多反应监测模式, 具有灵敏度高、重现性好的特点[5]。近年来, 随着分析仪器的不断发展与改进, 在线SPE与LC-MS联用已发展成比较成熟的一项分析技术, 该技术通过六通阀将SPE柱与LC-MS联接起来, 从而实现样品处理和样品分析的一体化[6], 可以大大简化操作。当前, 关于色谱-质谱[7, 8]、固相萃取-色谱-质谱联用[9]技术检测芬太尼均有报道, 但是关于在线固相萃取-液质联用技术检测生物检材中芬太尼的报道较少。

本文建立了血液样品中12种芬太尼类药物的在线固相萃取技术与液质联用相结合的快速检测方法, 具有操作简单方便、灵敏度高、样品量少、检出限低等特点, 适用于血液样品中芬太尼类药物的检测分析。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

1290-6470超高效液相色谱仪-三重四极杆串联质谱仪（美国Agilent公司）, 在线固相萃取模块（美国Agilent公司）, Milli-Q IQ 7003超纯水仪（美国Millipore公司）, 离心机3-18K（德国Sigma公司）。

芬太尼、对氟芬太尼、舒芬太尼、乙酰芬太尼、戊酰芬太尼、丙烯酰芬太尼、呋喃芬太尼、丁酰芬太尼、异丁酰芬太尼、4-氟丁酰芬太尼、4-氟异丁酰芬太尼、卡芬太尼（纯度99.5%, 公安部第三研究所）; 乙腈、甲醇、甲酸、醋酸铵（色谱纯, 美国Fisher公司）。

1.2 标准溶液制备

准确称取上述12种标准物质, 用甲醇溶解配制成1 mg/mL的单标储备液, 使用前根据需要用甲醇稀释配制成所需浓度混标溶液。

1.3 在线SPE和液相色谱条件

在线SPE柱：Agilent PLRP-S (15~20 µ m, 2.1 mm× 12.5 mm), 在线SPE泵为Agilent 1260四元泵, 流动相A为5%甲醇水, B为乙腈。分析柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm× 150 mm× 2.7 µ m）, 分析泵为Agilent 1290二元泵, 流动相A为5 mmol/L醋酸铵缓冲液（含0.1%甲酸）, B为乙腈。柱温40 ℃, 进样量20 µ L。六通阀切换、梯度上样及洗脱程序见表1, In-connection SPE-LC-MS/MS流路见图1。

表1 梯度上样及洗脱、六通阀切换程序 Table 1 Programs for gradient sampling, elution and valve swithching

图1 In-connection SPE-LC-MS/MS流路图Fig.1 Diagram of integral SPE(in-connection)-LC-MS/MS

In-connection SPE-LC-MS/MS流路：上样阶段, SPE阀1-2位相通, 检材样本经由自动进样器由SPE泵（四元泵）推入SPE柱, 样品进入SPE柱后, 在SPE柱上富集, 同时利用SPE流路流动相对富集SPE柱上盐分及水溶性物质等进行清洗, 完成样品上样, 该阶段SPE流路液体流入废液, 二元泵流路液体过色谱分析柱平衡。洗脱阶段, SPE阀3 min时瞬间切换至1-6位相通, SPE柱切入由二元泵、色谱分析柱、质谱组成的洗脱分析流路, 待测组分由二元泵所推送流动相从SPE柱上洗脱至色谱柱分离最后进入质谱进行检测, 待测组分在SPE柱上全部洗脱后, 10 min时SPE再切换至1-2位相通, 通过SPE四元泵推送高有机相（可自主选择）对SPE柱进行进一步洗杂活化, 以备再次使用。

1.4 质谱条件

电喷雾正离子模式（ESI+）, 多反应监测扫描模式（MRM）; 毛细管电压3 500 V, 喷嘴电压：500 V, 鞘气温度350 ℃, 鞘气流量11 L/min, 干燥气300 ℃, 干燥气流量5 L/min。12种芬太尼类药物质谱参数见表2。

表2 12种芬太尼类药物质谱参数 Table 2 MS parameters of 12 fentanyl-kind drugs
1.5 样品处理

取血液0.1 mL置于15 mL离心管中, 加入0.4 mL乙腈沉淀蛋白, 涡旋高速离心, 取上清液用纯水1∶ 1对等稀释, 用0.45 µ m滤膜过滤备检。

2 结果与讨论
2.1 色谱条件优化

图2显示12种芬太尼类药物的TIC色谱图。

图2 12种芬太尼类药物的TIC色谱图（0.1ng/mL）Fig.2 TIC chromatograms of 12 fentanyl-kind drugs (0.1ng/mL) [Counts vs. Acquisition Time (min)]

在12种芬太尼类化合物中4-氟丁酰芬太尼、4-氟异丁酰芬太尼以及丁酰芬太尼、异丁酰芬太尼分别互为同分异构体, 结构相似, 色谱保留性能相差不大, 色谱峰出峰时间集中, 难以完全分离, 通过对不同类型色谱柱优化实验, 最后选择了Poroshell 120 EC-C18分析柱, 实现了几种同分异构体的较好分离。从系统压力、分离效果、灵敏度等角度考虑, 本方法在甲醇、乙腈中间选择乙腈作为流动相。

目标物结构基团能吸收电子, 流动相中加入甲酸可以适当提高离子化效率, 实验结果表明使用5 mmol/L醋酸铵缓冲液（含0.1%甲酸）、乙腈作为色谱分析流动相, 可以实现几种同分异构体较好的色谱分离。

2.2 质谱条件优化

分别使用单标溶液, 选择ESI+电离模式, 利用仪器自带Optimizer自动优化软件对12种芬太尼类药物的母离子、子离子、碎裂电压、碰撞能量等质谱参数进行确定优化, 选择强度最高的两对离子作为定性分析离子, 选择强度最强的离子作为定量离子, 质谱主要参数见表2, MRM见图3。

图3 12种芬太尼类药物的MRM图Fig.3 MRM spectrums of 12 fentanyl-kind drugs

2.3 在线SPE上样流速影响

空白血中添加12种芬太尼类药物混标, 按1.5样品处理方法得到待测样品溶液, SPE泵上样流速分别为0.5、1.0、2.0、3.0 mL/min, 考察各流速条件下各组分SPE萃取回收率, 结果显示12种芬太尼类药物在上述各流速条件下各待测组分回收率差别不大, 综合考虑后端色谱峰形、洗杂效果等因素, 本实验SPE上样流速选择1.0 mL/min。

2.4 在线SPE流动相选择

考察100%纯水、水（含0.1%甲酸）、95%水（含0.1%甲酸）+5%乙腈、95%水+5%甲醇4种SPE上样流动相对萃取率的影响。实验结果表明, 12种芬太尼类物质在SPE柱上保留效果较好, 4种流动相下各组分萃取率差别不大。考虑到样品洗杂效果、回收率等因素, 上样SPE流动相选择95%水+5%甲醇。

2.5 在线SPE六通阀切换时间影响

空白血加入乙腈（体积比为1∶ 4）沉淀蛋白后进样, 1.5 min后基线回落走平, 所以洗杂去除盐分、水溶性的蛋白等物质至少需要1.5 min, 六通阀上样时间T1至少要大于1.5 min。12种芬太尼类药物混标进样, 上样时间分别设1、2、3、4、6、8 min, 考察各组分SPE萃取率, 结果各组分回收率无明显影响。综合考虑方法洗杂效果、待测组分回收率、检测时间, 本方法六通阀切换时间选择T1=3 min。

选择T1=3 min, SPE柱切入分析柱流路中（阀切换）后再切换回SPE流路时间分别设：10、15、20、25 min, 考察各组分萃取率。待测组分萃取率在上述4个时间条件下无明显差异, 即SPE柱切入分析柱流路中7 min后12种待测组分基本上都可以从SPE柱转移至分析柱上。此时SPE柱及时切回四元泵回路, 用高有机相冲洗洗杂, 活化SPE柱, 同时避免杂质等污染物进入分析柱及质谱中, 所以SPE柱通过六通阀再次切回SPE流路时间点选择10 min。

2.6 在线SPE样品中有机溶剂比例影响

实验发现纯有机溶剂标样直接进样, 溶剂效应明显, 峰形变宽, 部分组分峰重叠, 过在线SPE柱后进样峰形有改善, 但部分峰分离度较差。水样标准品直接进样、过SPE进样, 峰形正常。100%乙腈标样过SPE进样5 µ L, 峰形勉强可用; 50%乙腈过SPE进样10 µ L, 峰形尚可; 40%乙腈样品过SPE进样20 µ L, 峰形分离度正常（图4）。综合考虑方法检测限、色谱分离、实际样品等因素, 确定实际案件检验样品的处理为乙腈∶ 血=8∶ 2沉淀蛋白, 上清液用水相1∶ 1对等稀释后过SPE进样分析。

图4 12种芬太尼类药物的TIC色谱图
（不同溶剂比例）Fig.4 TIC chromatograms of 12 fentanyl-kind drugs undergone into different sampling treatments and injections

2.7 标准工作曲线和检测限

在血液中分别添加12种芬太尼类药物的混标工作液, 得到2.5、5、50、250、500、1 000 ng/mL系列浓度的加标样品溶液, 按上述1.5节方法对样品进行处理。

以定量离子峰面积对目标物浓度进行线性回归, 建立工作曲线, 考察添加浓度在2.5~1 000 ng/mL间的线性情况, 实验表明方法R2均大于0.999 0, 满足定量分析要求。12种芬太尼类药物回归方程、R2、检出限、定量限见表3, 检出限按3倍信噪比确定, 定量限按10倍信噪比确定。

表3 12种芬太尼类药物回归方程、R2、检出限、定量限 Table 3 12 fentanyl-kind drugs and their related regression equations, R2, detection limits and quantification limits
2.8 方法检测限、重现性及回收率

在血液基质中分别添加从低到高4个浓度的12种芬太尼类药物混标, 按优化后的方法条件, 对12种药物含量进行检测, 测得回收率、日内精密度、日间精密度如表4所示。

表4 血液中12种芬太尼类药物的回收率和精密度（n=6） Table 4 Intra- and inter-day RSDs of 12 fentanyl-kind drugs in blood sample (n=6)
3 结论

采用在线固相萃取技术与液质联用相结合的方式, 通过对色谱、质谱及在线SPE参数条件优化, 建立了12种芬太尼类药物的在线SPE-LC-MS/MS检验方法。该方法快速便捷、检材需求量少, 能够自动完成样品的在线净化富集, 回收率、灵敏度高, 能够满足实际案件检验需求。

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