引用本文
孟宇珍, 龚铎, 李文越, 文岩, 樊哲瑜, 张潮, 王涛, 傅善林, 尉志文, 贠克明. 液相色谱-三重四极杆质谱法同时检测生物检材中百草枯及其代谢物[J].刑事技术, 2022,47(1):49-57
MENG Yuzhen, GONG Duo, LI Wenyue, WEN Yan, FAN Zheyu, ZHANG Chao, WANG Tao, FU Shanlin, WEI Zhiwen, YUN Keming. Liquid Chromatography-triple Quadrupole Mass Spectrometry Simultaneously Detecting Paraquat and Metabolites in Biological Samples[J]. Forensic Science and Technology,2022,47(1): 49-57  
Doi: 10.16467/j.1008-3650.2021.0083
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液相色谱-三重四极杆质谱法同时检测生物检材中百草枯及其代谢物
孟宇珍1, 龚铎1, 李文越1, 文岩1,2, 樊哲瑜1, 张潮1, 王涛1, 傅善林1, 尉志文1,*, 贠克明1,*
1.山西医科大学法医学院,山西 晋中 030600
2.太原市公安局万柏林分局刑侦大队,太原 030001
* 通信作者简介：尉志文,男,山西大同人,博士,副教授,研究方向为法医毒理学和法医毒物分析。E-mail: weizhiwen2000@163.com;贠克明,男,山西运城人,博士,教授,研究方向为法医毒理学和法医毒物分析。E-mail: yunkeming5142@163.com

第一作者简介：孟宇珍,女,山西吕梁人,硕士研究生,研究方向为法医毒物动力学。E-mail: myz1564180015@163.com

收稿日期: 2021-01-25 修回日期: 2021-05-14
基金资助: 国家自然科学基金（8207072359）; 国家重点研发计划（2017YEC0803504、2018YFC0807403）; 国家科技基础性工作专项(2015FY11400); 科技强警基础工作专项（2019GABJC31）
摘要

目的 建立生物检材中同时检测百草枯（paraquat, PQ）及其主要代谢物单季铵盐（monoquat）、百草枯-单吡啶酮（paraquat-monopyridone, MP）、百草枯-联吡啶酮（paraquat-dipyridone, DP）、4-羧基-1-甲基吡啶盐（4-Carboxy-1-methylpyridinium ion, MINA）的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测方法。方法 以百草枯氘代内标（Paraquat-d8 Dichloride, PQ-D8）作为内标,检材样品调节pH后,经乙腈沉淀蛋白,使用不同色谱柱洗脱,在多反应监测模式下检测。结果 百草枯PQ、monoquat、MP、DP、MINA的线性范围分别是5~800ng/mL、0.5~80ng/mL、5~800ng/mL、2.5~400ng/mL、2~320ng/mL（ r均高于0.993）,日内、日间精密度（RSDs）分别在5%~14%、3%~13%、3%~15%、5%~13%、2%~15%之间,准确度（RE）分别在91%~116%、80%~100%、80%~111%、85%~114%、91%~114%之间。生物样品处理后自动进样器上室温放置72h,各物质的准确度分别在90%~119%、56%~125%、60%~110%、78%~98%、83%~117%之间。结论 本测定方法前处理过程简便,分离效果好,提取效率高,可使用本方法对疑似百草枯中毒的检材进行原体及代谢物的检测,为案件提供法律依据;本实验优化了课题组前期建立的生物样品中百草枯及monoquat、MP的检测方法,参考其案例结果,检测相应检材,对比分析,该检测方法在原体含量大幅下降时,痕量代谢物仍可检出。

关键词: 法医毒物分析; 百草枯; 液相色谱-串联质谱法; 百草枯代谢物
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2022)01-0049-09
Liquid Chromatography-triple Quadrupole Mass Spectrometry Simultaneously Detecting Paraquat and Metabolites in Biological Samples
MENG Yuzhen1, GONG Duo1, LI Wenyue1, WEN Yan1,2, FAN Zheyu1, ZHANG Chao1, WANG Tao1, FU Shanlin1, WEI Zhiwen1,*, YUN Keming1,*
1. School of Forensic Medicine, Shanxi Medical University, Jinzhong 030600, Shanxi, China
2. Criminal Investigation Brigade, Wanbailin Branch of Taiyuan Public Security Bureau, Taiyuan 030001, China
Abstract

Objective To establish an LC-MS/MS method for determination of paraquat (PQ) and its main metabolites [monoquat, paraquat-monopyridone (MP), paraquat-dipyridone (DP) and 4-carboxy-1-methylpyridinium ion (MINA)] in biological samples.Methods The biological samples (blood and tissues for this assay) were added with Paraquat-d8 Dichloride (PQ-D8), the internal standard substance, successively having them adjusted of pH values and precipitated of proteins with acetonitrile so that their supernatants were cleansed with cyclohexane and consecutively centrifuged to receive the lower layer of acetonitrile. The received fluid was undergone with drying, re-dissolved into methanol, centrifuged and filtrated through membrane, thereafter having been brought to elution with different chromatographic columns of LC-MS/MS apparatus. For the analysis of mass spectrometry into the eluate from column separation, LC-MS/MS apparatus was set under multiple reaction monitoring (MRM) mode plus positive ionization.Results Linear ranges were present with PQ, monoquat, MP, DP and MINA at each individual’s 5-800ng/mL, 0.5-80ng/mL, 5-800ng/mL, 2.5-400ng/mL and 2-320ng/mL (all rendering an r higher than 0.993), with their intra- and inter-day precision (RSDs) being 5%~14%, 3%~13%, 3%~15%, 5%~13% and 2%~15% plus the accuracy (RE) being 91%~116%, 80%~100%, 80%~111%, 85%~114% and 91%~114%, respectively. Besides, if the processed samples were placed with the autosampler at room temperature for 72 hours, each analyte (in the order of PQ, monoquat, MP, DP and MINA) demonstrated its own accuracy of 90~119%, 56%~125%, 60%~110%, 78%~98%, 83%~117%, respectively.Conclusions This approach set up here is of simple pretreatment, good separation effect and high extraction efficiency, capable of detecting PQ and metabolites from suspected paraquat poisoning samples. As the optimized update from our team’s earlier attempt to detect paraquat, monoquat and MP in biological samples, this approach could also have detected the trace metabolites even if the PQ is greatly reduced of content lower than certain favorable conditions.

Key words: forensic toxicology; paraquat; liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); paraquat metabolites

百草枯（paraquat, PQ）, 一种快速灭生性除草剂[1], 在农业生产中广泛使用, 对人畜有很强的毒性。百草枯可经由皮肤、黏膜、呼吸道、消化道等进入人体, 以肺部分布最多, 损伤最大, 肺纤维化伴呼吸衰竭是患者中毒后期死亡的主要原因, 且因其在临床上没有特效解毒的手段, 中毒死亡率高达80%以上[2, 3]。中毒患者体内百草枯浓度与死亡率有着密切的关系, 所以, 测定患者体内百草枯浓度不仅有助于准确诊断, 也对于制定合理的治疗方案有重要意义。

近年来, 有关百草枯原体的液质联用法[4, 5, 6, 7, 8, 9, 10]检测报道较多, 本实验旨在使用合适的前处理方法, 建立灵敏、快速、可应用于同时检测百草枯中毒患者血液中百草枯原体及其代谢物浓度的高效液相色谱-串联质谱检测方法。

1 实验部分
1.1 实验仪器、试剂与材料

高效液相色谱-质谱联用仪配有电喷雾电离源（Agilent, 美国）, Vortex Genie 2涡旋振荡器（Scientific Industries, 美国), Neofuge 15R高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司）, SC-3610低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）, AR2130/C 电子精密天平（Ohaus Corp, 美国）, Milli-Q integral系列纯水机（Millipore, 美国）, 全自动氮吹浓缩仪 ET3301（上海欧陆科技有限公司）。

甲酸铵、甲酸、甲醇、乙腈（色谱纯, sigma, 美国）, 乙腈、甲醇、环己烷（分析级, 天津市大茂化学试剂厂）。

百草枯（paraquat, PQ）标准品（Sigma, 德国）, 百草枯氘代内标（Paraquat-d8 Dichloride, PQ-D8）标准品（Dr.Ehrenstorfer Gmbh, 德国）, 单季铵盐（monoquat）、百草枯-单吡啶酮（paraquat-monopyridone, MP）、百草枯-联吡啶酮（paraquat-dipyridone, DP）、4-羧基-1-甲基吡啶盐（4-Carboxy-1-methylpyridinium ion, MINA）购自上海美迪西生物医药股份有限公司。

实验过程中所用标准品及内标储备液均用色谱级甲醇制得, 并于4 ℃冰箱避光保存, 使用时以纯甲醇稀释成适当浓度的标准工作溶液, 现用现配。

1.2 样品前处理

取血液样品500 μ L, 待测组织500 mg, 固性检材经超声细胞粉碎仪匀浆3 min, 加入25 μ L内标（100 ng/mL）混匀后, 加入等体积的含0.025%甲酸的水溶液, 涡旋30 s; 加入3 mL分析纯乙腈, 涡旋30 s, 4 500 r/min离心12 min, 取上清液加入3 mL的环己烷洗涤, 4 500 r/min离心8 min, 取下层的乙腈层溶剂转移至玻璃试管中, 45 ℃氮气流下挥干, 200 μ L色谱级甲醇定容, 涡旋1 min, 将复溶液转移至1.5 mL离心管中, 13 000 r/min离心5 min, 取上清液过0.22 μ m有机膜, 上机检测。

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件

1）PQ、monoquat、MP、DP

色谱柱：Allure PFPP柱(2.1 mm× 100 mm, 5 μ m), 柱温35 ℃, 进样量5 μ L。流动相A：2 mmol/L甲酸铵缓冲液-体积分数0.05%甲酸的水溶液; 流动相B：2 mmol/L甲酸铵缓冲液-体积分数0.05%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱程序：0~2 min, 100% A; 2~3min, 30% A; 3~5 min, 100% A; 5~8 min, 100% A。流速0.60 mL/min。

2） MINA

色谱柱：InfinityLab Poroshell 120 chiral-V柱（4.6 mm× 150 mm, 2.7 μ m）, 柱温30 ℃, 进样量5 μ L; 流动相为0.2%（质量分数）甲酸铵甲醇溶液, 等度洗脱, 流速0.60 mL/min。

1.3.2 质谱条件

电离方式：电喷雾电离源（AJS ESI）; 扫描方式：多反应监测（MRM）, 正离子模式; 电离电压：3.0 kV; 锥孔电压：30 V; 离子源温度：110 ℃; 脱溶剂气温度：350 ℃; 锥孔反吹气流速：45 L/h; 脱溶剂气流速：800 L/h。质谱检测参数见表1, 结构式见图1。

表1 百草枯及其代谢物的质谱参数 Table 1 Mass spectrometric parameters of paraquat and metabolites

图1 百草枯及其代谢物的结构式Fig.1 Evolutionally structural formula of paraquat and its metabolites

2 结果讨论
2.1 色谱柱和提取溶剂的选择

由于PQ的代谢物MINA与内源性物质的结构相似, 碎片离子相同, 色谱行为相同, 质谱分析不能解决同分异构体的检测问题, 无法选用普通色谱柱进行分离, 现采用InfinityLab Poroshell 120 chiral-V柱进行手性分离, 以万古霉素（大环内酯类抗生素）作为手性选择剂（键合固定相）, 极性离子模式（PI）, 流动相选用0.2%甲酸铵甲醇溶液, 将缓冲盐加入极性有机流动相, 改善可电离化合物的电离, 保留特性分离效果较好, 成功解决了内源性物质对MINA的干扰。

PQ及其代谢物monoquat、MP、DP[11, 12]的极性相差较大, 选用普通亲水柱分离效果不佳, 峰形易拖尾, 使用五氟苯基柱PFPP柱以一定浓度缓冲盐体系为流动相以改善其保留性质和峰形, 并利用梯度洗脱分离各物质, monoquat、MP和DP的色谱行为较为接近, 保留时间接近, 通过质谱行为可达到准确分离。

作为碱性离子型化合物, 百草枯及其代谢物易溶于酸性水溶液而不易溶于乙腈等有机试剂中, 在实验中发现只加入乙腈沉淀蛋白后回收率差, 且杂质峰很多, 而加入等体积的甲酸水后再加入3倍体积的乙腈溶液并用环己烷洗涤[13]可以显著提高百草枯和代谢物的回收率。本文比较了不同体积分数的甲酸水溶液和提取溶剂、洗涤溶剂的提取效率, 对百草枯及其代谢物的回收率进行比较, 发现无需使用造价昂贵的固相萃取小柱, 用简单有机溶剂多次提取, 回收率高, 确定使用1.2的前处理方法。

2.2 色谱分析

PQ、monoquat、MP、DP和MINA在选定的液相色谱-质谱分析条件下, 色谱行为良好, 保留时间分别为0.90、3.65、3.65、3.65、6.51 min, TIC及MRM图谱见图2~图7。

图2 血液样品中PQ的MRM色谱图及TIC图Fig.2 TIC and MRM of PQ in blood sample

图3 血液样品中PQ-D8的MRM色谱图及TIC图Fig.3 TIC and MRM of PQ-D8 in blood sample

图4 血液样品中monoquat的MRM色谱图及TIC图Fig.4 TIC and MRM of monoquat in blood sample

图5 血液样品中MP的MRM色谱图及TIC图Fig.5 TIC and MRM of MP in blood sample

图6 血液样品中DP的MRM色谱图及TIC图Fig.6 TIC and MRM of DP in blood sample

图7 血液样品中MINA的MRM色谱图及TIC图Fig.7 TIC and MRM of MINA in blood sample

2.3 线性范围

取相应检材分别加入百草枯及其代谢物标准溶液适量, 配制成一系列不同浓度的添加样品, 按照上述的前处理方法和仪器条件进行分析。

以目标物添加浓度（ng/mL）为横坐标（x）, 以峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线, 建立线性回归方程, 考察线性范围, 详细结果见表2。

表2 百草枯及其代谢物工作曲线线性范围 Table 2 Linear ranges of working curves for paraquat and its metabolite
2.4 准确度与精密度

取空白检材18份, 分别添加百草枯及其代谢物的标准储备液, 配制成低、中、高加标样品各6份。

按照本研究建立的方法进行样品前处理和检测, 每日测定3次, 连续测定3 d, 得到日内、日间精密度, 并根据工作曲线计算准确度, 详见表3。

表3 百草枯及其代谢物的准确度及精密度（x± s, n=6） Table 3 Accuracies and precisions of paraquat and its metabolites (x± s, n=6)
2.5 基质效应和提取回收率

在空白检材前处理液中加入百草枯及其代谢物的标准储备液制成基质标准溶液, 测定PQ及其代谢物的峰面积（A）, 再测定相同水平溶剂标准溶液中PQ及其代谢物的峰面积（B）, 平行测5次。

根据公式基质效应=A/B× 100%。提取回收率为空白加标样品中PQ及其代谢物的峰面积（C）与相同水平基质标准溶液中PQ及其代谢物的峰面积之比, 公式为提取回收率=C/A× 100%。PQ及其代谢物的评估水平见表4。结果显示, PQ及其代谢物在血液及脏器检材中存在较强的基质效应, 可以通过稳定同位素稀释法进行定量, 校正样品的基质效应和提取回收的不完全。

表4 生物样品中PQ及其代谢物的基质效应和提取回收率（n=5） Table 4 Matrix effects and extraction recoveries of PQ and its metabolites in biological samples (n=5)
2.6 稳定性

取空白检材18份, 分别添加百草枯及其代谢物的标准储备液, 配制成低、中、高加标样品各6份。按照本研究建立的方法进行样品前处理, 在自动进样器上室温放置72 h, 与标称值比较, 结果显示百草枯及其代谢物的相对偏差见表5。稳定性结果表明, 经前处理后的样品室温存放72 h后, 百草枯原体及其代谢物有所降解, 准确度有不同程度的下降, 该结果可对百草枯相关案件的鉴定提供参考。

表5 PQ及其代谢物的偏差 Table 5 Deviations of PQ and its metabolites
2.7 案件应用

王某, 男, 2017年7月6日口服百草枯农药, 2017年7月18日因肺纤维化致呼吸衰竭而死亡。于2017年7月20日进行尸体解剖, 取各组织脏器及心血送检[13], 相关检材被存放于-80℃冰箱, 2021年对其检材依照本文建立的方法进行复检（部分检材量少, 保存不良, 缺失）, 检出PQ及其代谢物的定量结果对比见表6。

表6 案例中PQ及其代谢物的含量比较 Table 6 Comparison of content of PQ and its metabolites from on case
3 讨论

百草枯中毒案件逐年增多, 与此相关的法医学鉴定工作也越来越多。当前国内外对于百草枯中毒或致死的鉴定主要依据百草枯原体, 对于代谢物的研究较少, 且检测所需样品量大, 检测限高, 或者技术难以在实验室普及。本实验方法所需样品量少（仅需血液500 μ L、脏器500 mg）, 对检材类型要求少, 可以针对心脏、肝脏、脾、肺、肾等检材进行前处理, 对缺乏液体检材案件的鉴定提供了帮助, 且定量结果更为精确, 达到pg级别, 建立了可同时检测百草枯原体及其主要代谢物浓度的高效液相色谱-串联质谱检测方法。

百草枯中毒案件受到染毒途径、检材采集及保存条件等因素影响, 对中毒时间长的死者解剖或检材存放时间过长、保存条件不利有可能检验不到PQ及其代谢物。这就对PQ中毒后的原体及其代谢物的分解动力学研究提出了要求, 以期发现更好的鉴定指标, 用于指导检材提取和保存。

通过对案件的复检研究可以发现, 常规的PQ中毒案件采取血液检材复检只能检出PQ, 因代谢物在血液中的含量比较低, 已接近甚至低于定量限, 存在定性、定量不准的问题, 如果仪器灵敏度差, 在血液中则有可能检测不到代谢物。中毒（死）者一般口服百草枯, 由肾排出50%~70%, 由于中毒持续时间长, 在肺中蓄积浓度高, 且在体内很少发生降解, 较小部分以monoquat、MP等代谢物的形式被检测到, 30%原体常随粪、尿排出, 故而PQ及其代谢物的含量在肾脏、肺脏中的分布均较高且稳定[13, 14], 因此在PQ中毒（死）案件的检验鉴定中, 建议可将肾脏、肺脏组织作为必取检材进行检验鉴定, 也能使后期的复检更为可靠。同时根据百草枯的分解动力学研究[15]结果, 在检材的最佳保存条件下、检测有效期内进行检测, 能使检测结果更准确。

PQ在碱性介质中极不稳定, 遇紫外线易分解[13], 有文献证实, PQ在外界土壤环境中会降解[16], 微生物降解也是很重要的一个途径, 自然界中的微生物菌群体会以PQ为氮源; 有研究发现, 在百草枯农药产品中也可检出PQ及代谢物, 提示商品在生产过程中可能有副产品或者在存置过程中百草枯产生了分解产物[15], 这可能对于百草枯相关案件的鉴定造成影响。也有研究证明, 原体及代谢物在生物样品中有不同的分解速度[15], 故进行百草枯案件的法医学鉴定时, 应谨慎考虑多种因素的影响。

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