引用本文
张驰, 郭立亮, 周轲, 宋振, 康克莱, 韦美甜, 高悦, 卓文腾, 季安全, 王乐. 运用法医学二代测序技术侦破19年久冷案[J].刑事技术, 2022,47(1):100-106
ZHANG Chi, GUO Liliang, ZHOU Ke, SONG Zhen, KANG Kelai, WEI Meitian, GAO Yue, ZHUO Wenteng, JI Anquan, WANG Le. Forensic Next Generation Sequencing Technology Having Played Role into Solving a 19-year-long Cold Case[J]. Forensic Science and Technology,2022,47(1): 100-106  
Doi: 10.16467/j.1008-3650.2021.0075
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运用法医学二代测序技术侦破19年久冷案
张驰1, 郭立亮1, 周轲2, 宋振3, 康克莱1, 韦美甜1, 高悦1, 卓文腾1, 季安全1,*, 王乐1,*
1.公安部物证鉴定中心,现场物证溯源技术国家工程实验室,法医遗传学公安部重点实验室,北京 100038
2.汉中市公安局,陕西 汉中723000
3.陕西省公安厅刑侦局,西安 710018
* 通信作者简介：季安全,男,山东莒县人,硕士,主任法医师,研究方向为法医遗传学。E-mail: aqjdna@163.com;王乐,男,辽宁沈阳人,博士,正高级警务技术任职资格,研究方向为法医遗传学。E-mail: wangle_02@163.com

第一作者简介：张驰,男,河北无极人,硕士,初级警务技术任职资格,研究方向为法医遗传学。E-mail: jannychina@126.com

收稿日期: 2021-03-19 修回日期: 2021-04-16
基金资助: 国家自然科学基金青年项目（81601649）; 国家重点研发计划（2017YFC0803503）; 公安部技术研究计划（2019JSYJA05）; 公安部科技强警基础工作专项（2019GABJC15）; 刑事技术“双十计划”攻关任务（2020SSGG0402）
摘要

基于Y染色体STR（Y-STR）多态性的男性家系排查技术帮助全国各地破获了诸多冷案积案。然而对于出现明显降解的生物检材,或因检出Y-STR基因座数量过少而无法开展有效排查。STRSeqTyperY68男性家系精细化排查试剂盒,定位于二代测序技术,利用MiSeq FGx二代测序平台可单管实现52个单拷贝Y-STR基因座、6个二拷贝Y-STR基因座、1个三拷贝Y-STR基因座和1个性别判定基因座的分型检测,并能同时支持STR长度和/或序列多态分型,全部基因座扩增子长度在350bp以下,且其中62个不大于300bp,适用于降解检材的检测。本文报道一起长达19年未破的强奸杀人案,用传统STR检测方法仅得到24个Y-STR基因座分型,部分300bp以上的Y-STR片段未检出,但通过二代测序方法使用STRSeqTyperY68试剂盒完整得到了67个Y-STR和1个性别基因座分型,从而帮助办案单位锁定了嫌疑人所在的男性家系,为案件侦破提供了关键技术支撑。

关键词: 法医遗传学; 二代测序; Y-STR; 男性家系排查; 降解检材; 冷案
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2022)01-0100-07
Forensic Next Generation Sequencing Technology Having Played Role into Solving a 19-year-long Cold Case
ZHANG Chi1, GUO Liliang1, ZHOU Ke2, SONG Zhen3, KANG Kelai1, WEI Meitian1, GAO Yue1, ZHUO Wenteng1, JI Anquan1,*, WANG Le1,*
1. National Engineering Laboratory for Forensic Science & MPS’ Key Laboratory of Forensic Genetics & Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security (MPS), Beijing 100038, China;
2. Hanzhong Public Security Bureau, Hanzhong 723000, Shaanxi, China
3. Division of Criminal Investigation of Shaanxi Provincial Public Security Department, Xi’an 710018, China;
Abstract

The male pedigree investigation technology, based on Y chromosomal STR (Y-STR) polymorphism, has helped to solve many cold cases. However, some cold cases cannot be resolved if the involving biological samples are significantly degraded, resulting in inability to carry out effective male pedigree tracing due to fewer number of Y- STR loci detected. STRSeqTyperY68 kit, purposed for forensic male pedigree screening on the basis of next generation sequencing, is competent of genotyping fifty-two single-copy Y-STR loci, six two-copy Y-STRs and one three-copy Y-STR plus a sex determinant locus in a single-tube reaction run with MiSeq FGx sequencing platform. Moreover, the kit supports length- and/or sequence-based STR polymorphism analyses simultaneously, having brought forth amplicons no longer than 350 bp for all the tested 68 loci among which 62 ones are shorter than 300 bp, as such making it suitable for detection of degraded samples. Here reported a 19-year-long unsolved rape homicidal case where only 24 Y-STRs were successfully genotyped with the traditional capillary electrophoresis, leaving some 300-plus-bp Y-STRs undetected. Adoption of STRSeqTyperY68 kit performed into next generation sequencing, had completely genotyped 67 Y-STRs and the sex determinant locus from the same samples, helping to fasten the suspect’s male family so that a key technical support was provided for the case to have been solved.

Key words: forensic genetics; next generation sequencing (NGS); Y-STR; male pedigree investigation; degraded sample; cold case

基于Y染色体STR（Y-STR）多态性的男性家系排查技术为诸多刑事案件的侦破提供了帮助[1, 2, 3, 4]。然而在实际排查过程中, 如果检出的Y-STR基因座数量太少, 比中的男性家系过多, 就无法顺利开展男性家系的排查工作。微量降解检材在冷案积案中很常见[5], 检测时容易出现Y-STR基因座丢失, 导致男性家系排查工作无法开展。这是由于现有Y-STR检测试剂盒多基于毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE）平台研制, 为了容纳更多的基因座, 不得不将部分基因座的扩增子设计在大片段区域。如Thermo Fisher公司基于CE平台的Yfiler™ Platinum PCR试剂盒可检测38个Y-STR基因座和3个Y-InDel, 其中有15个Y-STR基因座检测长度范围在300 bp以上。针对降解检材的Y-STR分型检测, 增加可检测Y-STR基因座数量、缩短扩增子长度是较有效的应对办法[6]。

二代测序（next generation sequencing, NGS）技术在进行复合扩增设计时, 将大量基因座设计在同样短的片段区间内[7], 以达到缩短扩增子的目的, 从而同时检测更多的STR基因座。前期工作中, 本团队以模拟的降解检材和骨骼、陈年血斑、脱落细胞、烟头、指甲等降解检材为研究对象, 证实了利用NGS技术检测严重降解的检材（DI = 8.947）相较CE技术更具优势[8, 9]; 近期研发的STRSeqTyperY68男性家系精细化排查试剂盒[10], 可单管实现52个单拷贝Y-STR基因座、6个二拷贝Y-STR基因座、1个三拷贝Y-STR基因座和1个性别基因座的分型检测, 并能报告长度和/或序列多态Y-STR分型信息; 68个基因座扩增片段长度均在350 bp以下, 而其中62个基因座扩增子长度更在300 bp以下, 可用于冷案中降解DNA检材检验。

“ 冷案” 一词来自于英美法系国家, 是指穷尽了所有侦查线索, 仍然无法侦破而久置的案件[11]。新技术的涌现为冷案侦破提供了新手段, 如法医系谱技术助力破获了一起长达14年未破的强奸杀人案[12]。本文中, 一起发生在2002年的强奸杀人案, 因一直缺乏有效侦查线索历时19年而未侦破。但基于二代测序技术使用STRSeqTyperY68男性家系精细化排查试剂盒对该案已经明显降解的检材再行检验, 结果检出了全部68个Y染色体基因座的分型, 为该案件进一步开展男性家系排查提供了充足数据, 最终该案成功告破, 冷案终结。

1 材料与方法
1.1 案情简介和前期检验情况

2002年5月, 陕西省某市发生一起强奸杀人案, 受害人为当地一高中女学生, 公安机关在现场提取的检材中检出嫌疑人9个常染色体STR基因座分型信息, 录入DNA数据库比对未比中。

1.2 DNA检验

1.2.1 DNA提取和毛细管电泳检测

使用FL-案件专用磁珠法DNA提取试剂盒（长春博坤生物科技有限公司）对现场提取的生物检材进行DNA提取和纯化。按照Yfiler™ Plus PCR 试剂盒（美国Thermo Fisher公司）和YFiler™ Platinum PCR试剂盒（美国Thermo Fisher公司）说明书在ProFlex™ PCR扩增仪完成PCR反应。毛细管电泳平台为3500型基因分析仪（美国Thermo Fisher公司）。

1.2.2 二代测序DNA检验

二代测序检验流程遵照行业标准GA/T 1693-2020《法庭科学DNA二代测序检验规范》[13]进行。

文库构建、定量和均一化：使用STRSeqTyperY68男性家系精细化排查试剂盒（公安部物证鉴定中心）进行靶向扩增和文库富集。靶向扩增体系为20 μ L , 其中降解检材DNA模板用量8 μ L, 其他阳性对照等DNA样品稀释到1 ng/μ L, 用量为1 μ L。扩增程序为：95 ℃预变性 5 min; 95 ℃、30 s, 60 ℃、2 min, 72 ℃、2 min, 运行25个循环; 72 ℃、5 min; 4 ℃保持。采用KAPA Library 定量试剂盒（瑞士Roche公司）进行文库定量。文库均一化为4 nM, 每个样本文库分别取样5 μ L后混合（降解检材的文库取样量为25 μ L）。

文库变性、稀释及上机测序：使用Miseq® Reagent Kit v3（600 cycle, 美国Illumina公司）、PhiX Control V3（美国Illumina公司）和0.2 M NaOH（美国Sigma-Aldrich公司）完成文库变性、稀释等操作。混合文库最终稀释到10 pM, PhiX Control V3用量为15%。测序平台为MiSeq FGx™ 二代测序仪（美国Illumina公司）, 测序模式为双向测序, 正反向均300 bp。

数据分析：毛细管电泳结果数据分析软件为GeneMapper ID-X。二代测序采用软件STRait Razor v3.0对下机Fastq文件进行数据分析, 得到各STR基因座等位基因的长度信息和序列信息, 测序深度阈值设定为30× 。以GRCh38（NCBIGenome: GCA_000001405）正义链作为参照, 分析上、下游侧翼序列的单核苷酸多态性（SNP）位点。

2 结果
2.1 测序质量参数与样本测序数据质量

测序质量参数显示簇密度（clusters density）为（1 148± 50）K/mm2, 检测通过的簇（clusters PF）占比（73.13± 14.88）%; 正向测序Phasing/Prephasing rate数值为0.165/0.022, 反向测序Phasing/Prephasing rate为0.122/0.038; Q30值为60%; 此外, 测序总reads数为25 350 330, 质量合格的reads数为18 507 346, 占比66.6%。

现场生物检材DNA样品测序得到约151 M数据, 经过数据分析后得到的68个Y染色体基因座分型结果, 总测序深度为45 758× , 平均测序深度为663× , 测序深度最低为31× （DYF387S1a/b的37分型）, 测序深度最高为3 440× （DYS389-I）, 其中, 测序深度在100× 以下的检出基因座为5个, 在100~500× 之间的检出基因座为33个, 在500~1000× 之间的检出基因座为15个, 在1 000× 以上的检出基因座为16个。

使用2800M基因组DNA进行阳性对照实验, 得到68个Y染色体基因座的完整分型结果, 且准确无误, 总测序深度为38 813× , 平均测序深度为571× 。阴性对照未发现有明显污染。

2.2 法医学二代测序技术增加了Y-STR信息量

本案在死者衣物上基于CE平台用Yfiler™ Plus PCR试剂盒和Yfiler™ Platinum PCR试剂盒检测后, 综合分析得到了DYS576等24个Y-STR基因座, DYS549等14个扩增子片段大于300 bp的Y-STR基因座则未得到明确分型, 而使用STRSeqTyperY68男性家系精细化排查试剂盒成功检出了DYS19等68个基因座分型, 其中包括CE检测得到的DYS19等24个Y-STR基因座（表1、图1）, 且分型结果一致, 另还成功检出CE丢失的DYS391等14个Y-STR基因座（表2、图2）、本次CE检测不包括的DYS388等29个Y-STR基因座（表3）和3个侧翼序列SNP位点, 分别是DYF387S1a/b下游侧翼区第43位C> T、DYS388上游侧翼区第24位G> A、DYS531上游侧翼区第43和44位之间插入GCATG（表1、表3）, 上述67个Y-STR基因座分型结果均为STR序列多态性分型, 序列多态STR等位基因命名结果遵照公共安全行业标准GA/T 1694-2020《序列多态STR等位基因命名规则》[14]对等位基因命名。

表1 CE方法成功检出的24个Y-STR基因座的NGS分型结果 Table 1 NGS typing results of the 24 Y-STR loci which were also successfully detected with CE

图1 CE检测结果(A和C为Yfiler™ Plus PCR试剂盒检测结果, A为电泳图谱, C为每个基因座的RFU数值; B和D为YFiler™ Platinum PCR试剂盒检测结果, B为电泳图谱, D为每个基因座的RFU分布)Fig.1 Detection results from CE (A and C were the results from Yfiler™ Plus PCR amplification kit, with A: the electrophoretogram and C: RFUs for each locus; B and D were the results from YFiler™ Platinum PCR amplification kit, with B: the electrophoretogram and D: RFUs for each locus)

表2 CE方法丢失的14个Y-STR基因座的NGS分型结果 Table 2 NGS typing results of the 14 Y-STR loci which dropped out from CE detection

图2 Yfiler™ Platinum PCR试剂盒与STRSeqTyperY68男性家系精细化排查试剂盒扩增子长度范围分布Fig.2 Size ranges of the amplicons resulted from Yfiler™ Platinum PCR amplification kit and the STRSeqTyperY68 kit

表3 CE检测体系不包括的29个Y-STR基因座的NGS检测结果 Table 3 NGS typing results of 29 Y-STR loci which were not enclosed with the CE kits
2.3 成功锁定嫌疑人男性家系

办案单位根据68个Y染色体基因座分型数据迅速开展了Y-STR比对工作, 零容差成功锁定了一唐姓家系（图3）。经使用AmpFLSTR™ Identifiler™ PCR试剂盒进一步比中了嫌疑人, 检测出了15个扩增片段小于350 bp的常染色体STR基因座, 且与现场检材的该15个常染色体STR基因座分型完全一致。嫌疑人被抓获后如实交代了犯罪事实, 该命案历时19年终于告破。

图3 嫌疑人所在男性家系图（图中黑色带边框标记为该家系已过世人员, 绿色标记人员为Y-STR比中的唐某, 红色标记人员为本案嫌疑人）Fig.3 Male pedigree of the suspect (The individuals marked with black enclosure are the deceased members; the person shown with green color is the surnaming Tang who was locked from Y-STR; the person indicated with red color is one suspect, too)

3 讨论

Y-STR为男性特有, 具父系纵向、单倍型遗传的特点, 故常用于男性家系的排查[1, 2, 3, 4]。在本案中, CE结果显示精斑检材出现了明显的降解特征, 长度大于360 bp的Y-STR基因座几乎全部丢失, 而其他Y-STR基因座的数据质量不佳, 综合Yfiler™ Plus PCR试剂盒和Yfiler™ Platinum PCR试剂盒检测结果, 荧光峰高在100 RFU以上的基因座仅有24个, 占可检测基因座总数的58.5%。对于NGS检测结果, 测序深度越高, 分型结果越可信。本次测序深度阈值设定为30× , 测序深度在100× 以上的基因座有64个, 占可检测基因座总数的92.8%。

基于NGS技术可将常规STR基因座作为mini-STR基因座使用, 引物设计时各基因座片段长度完全可以重叠在小片段区域且互不干扰[15]。STRSeqTyperY68男性家系精细化排查试剂盒适用于血液、精斑、唾液（烟蒂）、肋软骨组织、接触DNA等法医常见生物检材, 应用于本案其优势在于：1）获取基因座数目众多。该试剂盒基因座覆盖了公安部物证鉴定中心DNATyper™ Y26, 北京基点认知公司Goldeneye® DNA身份鉴定系统Y-Plus, Thermo Fisher公司Yfiler™ Platinum PCR试剂盒、Yfiler™ Plus PCR试剂盒和AmpFLSTR™ Yfiler™ PCR试剂盒, Promega公司PowerPlex® Y23 System等CE平台试剂盒全部的Y-STR基因座[10]。2）扩增子长度范围较短, 获得了CE结果中丢失的长片段基因座。CE检测中丢失的14个基因座的扩增子长度范围在358~538 bp, 相应基因座在本试剂盒中的扩增子长度范围在92~290 bp。基于上述优势, STRSeqTyperY68男性家系精细化排查试剂盒成功检出了本案中降解检材的68个Y染色体基因座, 为办案单位迅速侦破此冷案提供了技术支持, 实证了NGS技术在疑难案件中对降解检材的检测优势, 充分证明了法医学二代测序技术在实战中的应用价值。随着公安实战中使用的Y-STR基因座数目越来越多, 不同试剂盒之间可能存在STR等位基因命名不一致的情况[16, 17]。为避免因此发生比对错误, 一方面应遵照《序列多态STR等位基因命名规则》[14]等进行规范命名, 另一方面在使用来源于不同试剂盒的数据进行分型比对时, 可使用9947A、2800M等DNA标准品对分型结果进行校验。

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