引用本文
蔺大伟, 张云峰, 郑佳佳, 李文海, 饶渝兰, 李秀云, 孙红雷, 邵凯, 夏庆兵. 超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法检测血斑中乙醇生物标志物[J].刑事技术, 2021,46(6):594-599
LIN Dawei, ZHANG Yunfeng, ZHENG Jiajia, LI Wenhai, RAO Yulan, LI Xiuyun, SUN Honglei, SHAO Kai, XIA Qingbing. UPLC-Q/eOrbitrap HRMS Determining Alcohol Biomarkers in Bloodstains[J]. Forensic Science and Technology,2021,46(6): 594-599  
Doi: 10.16467/j.1008-3650.2021.0086
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超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法检测血斑中乙醇生物标志物
蔺大伟1, 张云峰2,*, 郑佳佳1, 李文海1, 饶渝兰3, 李秀云1, 孙红雷1, 邵凯1, 夏庆兵1
1.泰安市公安局刑事科学技术研究所,山东 泰安 271000
2.公安部物证鉴定中心,北京 100038
3.复旦大学基础医学院法医学系,上海 200032
* 通信作者简介：张云峰,女,河南范县人,硕士,副研究员,研究方向为法医毒物分析与中毒案件检验鉴定。E-mail: yunfeng-2002@sohu.com

第一作者简介：蔺大伟,男,山东菏泽人,学士,高级工程师,研究方向为法医毒物分析。E-mail: lindawei1976@163.com

收稿日期: 2020-11-24 修回日期: 2021-05-25
基金资助: 北京市现场物证检验工程技术研究中心开放课题（2018CSEEKFKT07）
摘要

目的 建立了超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q/Orbitrap HRMS）测定血液斑痕中两种乙醇生物标志物乙基葡萄糖醛酸苷（EtG）和硫酸乙酯（EtS）的检测方法。方法 采用空白静脉血液加标后在载玻片上制备成血液斑痕,取样后用50%甲醇提取,通过超高效液相色谱高分辨质谱进行检测;色谱柱Synicronis C18（150mm×2.1mm×5.0μm）分离,流动相A为0.1%的甲酸水,流动相B为含0.1%甲酸的甲醇-乙腈（1:1）,梯度洗脱,离子源为加热电喷雾离子化源（HESI）,扫描方式全扫描模式,负离子模式检测。结果 该方法在EtG、EtS浓度为0.2~100ng/patch范围内有良好线性关系（ R2=0.9991、0.9994）,样品回收率良好,日内与日间精密度小于15%,基质效应在85%~120%之间。结论 利用该方法可有效测定血液斑痕中的乙醇生物标志物。

关键词: 超高效液相色谱; 四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱; 血液斑痕; 乙醇生物标志物
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2021)06-0594-06
UPLC-Q/eOrbitrap HRMS Determining Alcohol Biomarkers in Bloodstains
LIN Dawei1, ZHANG Yunfeng2,*, ZHENG Jiajia1, LI Wenhai1, RAO Yulan3, LI Xiuyun1, SUN Honglei1, SHAO Kai1, XIA Qingbing1
1. Institute of Forensic Science, Taian Public Security Bureau, Taian 271000, Shandong, China
2. Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing 100038, China
3. Department of Forensic Medicine, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China
Abstract

Objective To establish a method for determination of two alcohol biomarkers (ethyl glucuronide, EtG; ethyl sulphate, EtS) in bloodstains via ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field orbitrap high-resolution mass spectrometry (UPLC-Q/eOrbitrap HRMS).Methods The bloodstains were prepared on clean glass slide where to have dropped the venous blood spiked of EtG or EtS, having them extracted with 50% hydrated methanol. The bloodstain-extracted supernatant was separated on a Synicronis C18 column (150mm×2.1mm×5.0μm) with gradient elution that was run through the mobile phases consisting of 0.1% formic acid (phase A) and acetonitrile : methanol (v/v 1:1) (containing 0.1% formic acid ) (phase B). MS tests were coupled with HPLC under HESI (heating electrospray ionization) source operated in negative ionization full-scan mode.Results Both EtG and EtS were linear with their calibration curves among the range of 0.2-100ng/patch ( R2=0.9991, 0.9994), showing good recovery, intra- and inter-day precision less than 15%. The matrix effect was in the range of 85%-120%.Conclusion The method is effective to detect alcohol biomarkers (EtG and EtS) in bloodstains.

Key words: ultra-high performance liquid chromatography (UPLC); quadrupole/electrostatic field orbitrap high-resolution mass spectrometry (Q/eOrbitrap HRMS); bloodstains; alcohol biomarker

利用案件现场遗留的血液斑痕中痕量代谢成分对涉案人员进行形象刻画, 缩小排查范围, 是办案单位提出的迫切要求[1]。乙基葡萄糖醛酸苷（ethyl glucuronide, EtG）、硫酸乙酯（ethyl sulfate, EtS）是乙醇体内代谢的直接生物标志物, 仅在有乙醇摄入的情况下存在, 且不受疾病、生理因素影响, 是判断涉案人员是否饮酒的敏感性和特异性指标[2, 3, 4, 5, 6, 7, 8]。据文献报道[9, 10, 11], 检测头发、血液、尿液中的EtG、EtS可应用于判断酒后驾驶、尸体中乙醇来源、相关人员是否酗酒等情况, 但是通过检测血液斑痕中EtG、EtS对刑事案件中涉案人员进行人物刻画尚未见报道。

四极杆/静电场轨道阱（Q/Orbitrap）高分辨质谱的质量分辨率高, 可以获得化合物的精确分子量, 适用于中小分子的痕量成分在复杂基质中的筛选和确证。本文利用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪, 分析案件现场遗留的血液斑痕中的EtG、EtS, 刻画涉案人员特征, 为侦查提供依据, 具有较强的实践意义。

1 实验部分
1.1 仪器和试剂

Q Exactive Foucs高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨液质联用仪（ThermoFisher, 美国）, Milli-Q纯水系统（Millipore, 美国）, Syncronis C18液相色谱柱（ThermoFisher, 美国）。

EtG、EtS以及EtG-D5、EtS-D5标准品均购自加拿大Toronto Research Chemicals公司。

1.2 血液斑痕的制备

用移液器准确移取抗凝管保存的全血10 μ L, 滴在载玻片上, 每个样本制作3个平行样, 放置12 h, 备用。

1.3 样品前处理

用手术刀片将载玻片上的血块刮下, 放入2.0 mL具塞离心管中, 加入200 μ L甲醇水（1:1）振荡20 min, 5 000 r/min离心5 min, 上清液过0.22 μ m有机滤膜, 待测。

1.4 色谱条件

色谱柱：Syncronis C18（150 mm × 2.1 mm × 5.0 μ m）液相色谱柱; 流速：0.5 mL/min; 进样量：1 μ L; 流动相A为体积分数0.1%的甲酸水, 流动相B为含0.1%甲酸的甲醇-乙腈（1:1）; 梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序 Table 1 Gradient setup for mobile phases
1.5 质谱条件

离子源：可加热电喷雾离子源（HESI）; 扫描模式：负离子模式; 采集方式：全扫描/数据依赖二级扫描（Full MS/ddMS2）; 离子传输管温度：320 ℃; 鞘气（N2）：60 arb; 辅助气（N2）：20 arb; 一级扫描分辨率：70 000; 二级扫描分辨率：17 500; 二级质谱碰撞能为归一化碰撞能（NCE）：40%、60%。

2 结果和讨论
2.1 色谱条件的优化

本实验考察了ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（50 mm × 2.1 mm × 1.8 μ m）、Hypersil Gold色谱柱（50 mm × 2.1 mm × 1.8 μ m）、Accucore Helic色谱柱（50 mm × 2.1 mm × 2.6 μ m）、Accucore aQ色谱柱（50 mm × 2.1 mm × 2.6 μ m）、KinetexF5色谱柱（50 mm × 2.1 mm × 2.6 μ m）、Synicronis C18色谱柱（150 mm × 2.1mm × 5.0 μ m）。EtS分子量小, 极性强, 表现了较弱的保留性, 而Syncronis C18（150 mm × 2.1 mm × 5.0 μ m）液相色谱柱对EtG、EtS均有较好的保留。

考察了甲醇水、乙腈水和甲醇-乙腈（1:1）水作为流动相对检测的影响, 乙腈水和甲醇-乙腈（1:1）水体系EtS、EtG的响应值要高于甲醇水, 甲醇-乙腈（1:1）水体系较乙腈水体系更有助于EtS、EtG在色谱柱上的保留。本实验在水相和有机相中分别加入了体积分数0.1%的甲酸, 结果表明加入甲酸能够明显改善峰形; 在流动相中加入2 mmoL甲酸铵, 但对EtS、EtG响应强度和峰形改善并无提高。所以, 本实验选用含0.1%甲酸的水体系作为流动相A, 含0.1%甲酸的甲醇-乙腈（1:1）为流动相B。

2.2 母离子及子离子的精确质量数

在上述仪器条件下, EtG、EtS和其氘代内标的分析质量精度、母离子及二级碎片离子信息见表2。本实验优化了二级质谱所用的归一化碰撞能（NCE）, EtG和EtG-D5在NCE为40%、EtS和EtS-D5在NCE为60%时, 可获得满意的二级离子碎片。

表2 EtG、EtS和氘代内标的精确质量数和测量准确度 Table 2 Accurate molecular weights and mass accuracy of EtG, EtS, EtG-D5 and EtS-D5
2.3 色谱图及质谱图

参照方法1.2和1.3处理空白血添加2 μ g/mL EtG、EtS、EtG-D5、EtS-D5后, 采用1.4和1.5方法进样检测, 空白血添加样品中出现了 EtG、EtS、EtG-D5、EtS-D5色谱峰, 保留时间分别为1.52、1.18、1.47、1.16 min, 保留时间处无明显干扰物质, 其色谱图和二级质谱图如图1~2。

图1 空白血添加2 μ g/mL EtG、EtS、EtG-D5、EtS-D5色谱图Fig.1 Chromatograms of blank blood spiked with EtG, EtS, EtG-D5, EtS-D5 (2μ g/mL)

图2 空白血添加2 μ g/mL EtG（a）和EtS（b）质谱图Fig.2 Mass spectrums of blank blood spiked with EtG (2μ g/mL) (a) and EtS (2μ g/mL) (b)

2.4 前处理优化

本实验考察了乙腈、乙腈水、甲醇、甲醇水作为溶剂对血液斑痕中的EtG、EtS提取回收率, 使用甲醇水、甲醇和乙腈水的回收率明显高于乙腈, 而乙腈水和甲醇-乙腈（1:1）作为提取溶剂时, 溶剂效应明显。

本实验考察了不同浓度的甲醇对提取效果的影响, 结果如表3所示, 最后选用体积比50%的甲醇作为提取溶剂。

表3 不同甲醇浓度对提取效果的影响 Table 3 Effect of concentration-different methanol on recovery

另外, 通过考察不同振荡时间（5、10、20、30 min）对提取效果的影响, 发现当振荡提取时间大于20 min时, 回收率无显著性差异, 如表4。

表4 不同提取时间对提取效果的影响 Table 4 Effect of duration-different extraction on recovery
2.5 线性范围和检测限

取空白血分别添加EtG、EtS以及EtG-D5、EtS-D5, 配制成20、100、200、500 ng/mL和1、2、10 μ g/mL, 内标浓度为1 μ g/mL的血样, 取10 μ L分别滴加在载玻片上, 制成0.2、1、2、5、10、20、100 ng/patch的血液斑痕, 按照实验方法处理。以目标化合物与其氘代内标的峰面积比（y）对样品浓度（x）做线性回归方程, 结果如表5, 表明EtG、EtS定量线性良好。

表5 EtG、EtS的工作曲线 Table 5 Work curve of EtG and EtS
2.6 回收率和精密度

取空白血液分别添加EtG、EtS配制成50、500、1 250 ng/mL的低、中、高3个质量浓度的血液样本, 制得0.5、5、12.5 ng/patch的血液斑痕, 每个浓度3份样品。参照方法1.2和1.3处理后制得10、100、250 ng/mL添加浓度的待测液体（EtG-D5、EtS-D5作为内标, 浓度为50 ng/mL）, 采用1.4和1.5方法检测。每个添加水平平行测定3次, 计算其回收率和日内相对标准偏差; 连续测定3 d计算日间回收率及相对标准偏差。结果表明, 本方法具有良好的回收率和精密度, 如表6。

表6 血液斑痕中EtG、EtS的添加回收率和精密度 Table 6 Recoveries and precisions of either EtG or EtS spiked into bloodstains
2.7 基质效应

取空白血参照方法1.2、1.3制作空白血液斑痕提取液（EtG-D5、EtG-D5作为内标, 浓度为50 ng/mL）, 分别添加低、中、高3个浓度EtG、EtS标准试剂, 使其最终浓度为10、100、250 ng/mL, 作为基质提取添加标准组M。另分别取浓度为10、100、250 ng/mL EtG、EtS标准试剂, 作为不添加基质组NM。两组样品分别采用1.4、1.5方法检测。评价基质效应采用基质因子, 即M与NM峰面积比, 结果如表7, 血液斑痕在低浓度时EtG和EtS表现为基质增强效应, 而随着浓度增大基质增强效应减弱。该提取检测方法不存在明显的基质效应, 适用于血液斑痕中EtG、EtS的检测。

表7 血液斑痕中EtG、EtS的基质效应 Table 7 Matrix effects of either EtG or EtS spiked into bloodstains
2.8 稳定性

取空白血液添加EtG、EtS配制成10 ng/patch的血液斑痕, 参照方法1.2、1.3处理后制得200 ng/mL添加浓度的待测液体（EtG-D5、EtS-D5作为内标, 浓度为50 ng/mL）, 采用1.4、1.5方法检测。分别保存在4、20和-20 ℃条件下, 在不同的时间点检测 EtG、EtS 的含量, 回收率结果如表8。血液斑痕中EtG、EtS 均会发生分解, 20 ℃最不稳定, -20 ℃最稳定, 其中EtG相对于EtS更容易分解。在案件检材的保存中, 应注意冷冻, 及时检测。

表8 血液斑痕中EtG、EtS的稳定性（x± s, %） Table 8 Temperature-/Time-dependent stability of EtG and EtS in bloodstain (x± s, %)
2.9 案例应用

2019年10月29日, 上午10时许泰汶分局汶西派出所接警称：陈某某因不明原因死亡。现场勘查, 死者双侧乳头被剪掉, 因被发现时尸体已腐败, 静脉血和心血未能取得。提取现场血迹, 应用该方法检测, 结果检出EtG、EtS成分, 结合调查材料证实受害人被杀害前有酗酒行为。

3 讨论

本研究确立了血液斑痕中乙醇生物标志物— — 乙基葡萄糖醛酸苷（EtG）和硫酸乙酯（EtS）的超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱检验方法, 该方法能够快速筛查血液斑痕中的目标物, 确定犯罪嫌疑人体内乙醇代谢物质的存在, 据此刻画嫌疑人特征, 实现肇事逃逸追逃、刑事案件涉案人员范围排查等, 为案件的侦破提供一定的科学依据。

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