18种样本采集卡性能比较分析
[卢亮1 
, 王延滨2 , 马建伟2 , 申君毅3 , 朱典1 , 陈飞秀1 , 仲利静1 , 田雪梅1 , 赵蕾1, * ]
, 王延滨]
引用本文
卢亮, 王延滨, 马建伟, 申君毅, 朱典, 陈飞秀, 仲利静, 田雪梅, 赵蕾. 18种样本采集卡性能比较分析[J].刑事技术, 2021,46(5):537-541
LU Liang, WANG Yanbin, MA Jianwei, SHEN Junyi, ZHU Dian, CHEN Feixiu, ZHONG Lijing, TIAN Xuemei, ZHAO Lei. Comparison and Analysis into Performance of 18 Kinds of Sample Acquisition Card[J]. Forensic Science and Technology,2021,46(5): 537-541
Doi: 10.16467/j.1008-3650.2021.0131
LU Liang, WANG Yanbin, MA Jianwei, SHEN Junyi, ZHU Dian, CHEN Feixiu, ZHONG Lijing, TIAN Xuemei, ZHAO Lei. Comparison and Analysis into Performance of 18 Kinds of Sample Acquisition Card[J]. Forensic Science and Technology,2021,46(5): 537-541
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18种样本采集卡性能比较分析
第一作者简介：卢亮,男,江苏连云港人,硕士,助理研究员,研究方向为法医遗传学。E-mail: buptluliang@sina.com
摘要
口腔细胞样本和血液样本是法医DNA检验与数据库建设常见（用）的样本类型,FTA卡以其能够抑制微生物生长、抗紫外线照射的功能而常被选用于这两类样本的保存。本文报道收集上述两类样品采集卡：6种针对口腔细胞样本（含FTA指示卡）、12种用于血液样本（含FTA卡）,就它们样本保存区域的属性、抑制微生物、抗紫外线照射以及PCR扩增效果等进行系统分析。结果发现只有具有化学物质涂层的采集卡才有有效抑制微生物生长、抗紫外线照射的功能;而具有涂层的采集卡则因涂层中存在的化学物质会对PCR扩增效果略有影响。基于以上分析,本文认为具有抑制微生物生长、抗紫外线照射功能的口腔细胞样本和/或血液样本采集卡更适合法医DNA检验与数据库样本的保存及STR检测。
关键词:
法医遗传学; 生物样本采集卡; 抑菌
中图分类号:DF795.2
文献标志码:A
文章编号:1008-3650(2021)05-0537-05
Comparison and Analysis into Performance of 18 Kinds of Sample Acquisition Card
LU Liang1 , WANG Yanbin2 , MA Jianwei2 , SHEN Junyi3 , ZHU Dian1 , CHEN Feixiu1 , ZHONG Lijing1 , TIAN Xuemei1 , ZHAO Lei1, *
, WANG Yanbin
Abstract
Saliva (usually harboring buccal cells) and blood samples are among commonly-used evidential materials for DNA detection and database construction. FTA card, boasted of ability to inhibit microbial growth and resist ultraviolet radiation, is therewith frequently selected to preserve oral cells and/or blood samples. With collection of six kinds of saliva sample acquisition card (including FTA indicator card) and twelve ones for blood sample (FTA card enclosed), this paper systematically analyzed these cards about their properties of sample-storage area, microorganism inhibition, resistance against ultraviolet radiation and effect on PCR amplification. It revealed that only the chemical-processing cards were able to effectively inhibit the growth of microorganisms. Moreover, the cards owning coating layer can slightly affect PCR amplification with the presence of chemical substances in coating layer. Therefore, suggestions are kindly given that the appropriate selection should be placed on the sample acquisition cards that are functional of inhibiting the growth of microorganisms and resisting against ultraviolet radiation.
Key words:
forensic genetics; biological sample collection card; anti-microorganism
口腔细胞样本和血液样本为法医DNA检验和数据库建设所常见（用）。通常, 此两类样本在采集后会被转移至采集卡上以便既可用于后续STR检测, 同时也为案件复检而作长期保存。由于被采集唾液及血液样本中所携带的微生物（如霉菌、细菌等）会降解细胞DNA, 而这尤以微生物易滋长的温热潮湿地区（如南方大部分地区）为甚; 另外, 在长期保存过程中, 阳光照射（尤其是紫外线照射）也会造成DNA降解, 故上述因素都会严重影响被保存样本的稳定性, 不利于后期的STR分析[1]。国内现已有大量的口腔细胞样本和血液样本采集卡产品, 但其中有的仅为普通滤纸, 有的则做了涂层技术处理, 其功能与质量良莠不齐。为此, 本研究收集了市场上有代表性的6种口腔细胞样本和12种血液样本采集卡, 就以下四个方面性能进行系统分析：1）电导率; 2）PCR扩增效果; 3）紫外照射防护功能; 4）抑菌效果（抑制微生物生长的能力）。
1 材料与方法
1.1 样品来源
6种口腔细胞采集卡提供单位为长春市博坤生物科技有限公司、GE Healthcare Life Sciences、湖北沁远生物科技有限公司、苏州新海生物科技股份有限公司、天津诺维莱博科技有限公司和武汉骥腾生物科技有限公司（按拼音顺序排列）。
12种血液样本采集卡提供单位为北京泰德富臣科贸有限公司、北京华恩时代科技发展有限公司、北京市达博创新科技开发有限公司、长沙市芙蓉区骥腾生物科技有限公司、GE Healthcare Life Sciences、合肥衡磊警用科技股份有限公司、湖北沁远生物科技有限公司、苏州新海生物科技股份有限公司、山东成武贝斯特实验器材有限公司、天津诺维莱博科技有限公司等10家公司以及一个未知名生产厂家（按拼音顺序排列）。
1.2 主要仪器与材料
SH-241恒温恒湿培养箱（Espec）, 7500型荧光定量PCR仪、3500XL型遗传分析仪和9700型PCR仪（ABI）, Mini Vortexer涡旋振荡器（VWR）, Allegra6KRCentrifuge离心机、DU800紫外分光光度计（Beckman）, 电导仪（Waters）, 超净台（苏州净化设备有限公司）, 电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）, 金属浴（Eppendorf）。
1.3 实验试剂
人类基因组DNA 9947（苏州新海生物科技股份有限公司）, GlobalFiler™ Express PCR Amplification Kit、甲酰胺（ABI）, 一级水（即符合实验室用水标准GB/T 6682-2008, 其电导率≤0.01 mS/m, 25℃）, 黑曲霉孢子悬液（106 CFU/mL）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（北京三药科技开发公司）, pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液（杭州微生物试剂有限公司）。
1.4 实验方法
1.4.1 电导率
使用直径6 mm的打孔器对采集卡的采样保存区域打孔, 每张采集卡打3片, 每片放入1.5 mL的离心管中并加入1 mL一级水, 涡旋振荡, 室温放置30 min, 使用电导率仪测试浸出液的电导率并求其平均值。
1.4.2 PCR扩增效果
同1.4.1采集并制成直径6 mm的圆形纸片, 作为待测样品。取4 μL 10 ng/μL的人基因组DNA9947, 加载至圆形纸片上, 室温晾干后再转移入1.5 mL离心管中, 向离心管中加入150 μL一级水并置于金属浴中, 95 ℃、800 r/min处理15 min。涡旋振荡、简短离心, 吸取上清液, 制得DNA洗脱液。
取GlobalFilerTM Express Master Mix 4 μL, GlobalFilerTM Express Primer Set 4 μL, 一级水1 μL, DNA洗脱液1 μL, 进行下列参数扩增：95 ℃, 1 min; 94 ℃, 3 s; 60 ℃, 30 s; 29循环, 60 ℃, 8 min。
将甲酰胺和内标按10:0.1比例混匀, 再分装9 μL至96孔板中。取1 μL扩增产物加至96孔板。混匀离心, 加载至3500 XL型遗传分析仪进行毛细管电泳。计算毛细管图谱中各STR基因座的产物峰检出数和检出率。
1.4.3 紫外照射保护功能
同1.4.1采集并制成直径6 mm的圆形纸片, 作为待测样品。取4 μL 10 ng/μL的人基因组DNA9947, 加载至圆形纸片上, 室温晾干。将含有DNA的圆形纸片置于紫外光下照射（光强为100 μW/cm2）。每种卡均分别照射2/12/30/120 min。将照射后的圆形纸片转移至1.5 mL离心管中, 加入150 μL一级水并置于金属浴中, 95 ℃、800 r/min处理15 min。涡旋振荡、简短离心, 吸取上清液, 制得DNA洗脱液。
PCR检测方法同1.4.2。每个生产厂家的产品每次取2个采集卡样品, 重复检测3次。计算STR基因座的产物峰检出数、检出率和检出率的标准差。
1.4.4 抑菌效果
1~18号采集卡编号为1#~18#, 将层析滤纸作为阳性对照。使用打孔器对采集卡的样本保存区域和层析滤纸打孔, 制成直径6 mm圆形纸片。
将样品贴在沙氏琼脂培养基表面（直径90 mm的固体培养皿）, 每个培养皿放置4片（其中, 一个为阳性对照, 3个为待检测的采集卡样品）。分别在每个样品纸片上加载霉菌孢子悬液（106 CFU/mL）10 μL。将培养皿置于培养箱中, 28 ℃培养24~48 h, 观察并记录各样品表面的试验菌生长情况[2]。
2 结果及分析
2.1 电导率
2.1.1 结果
18种采集卡的样本保存区域材质均为滤纸, 其浸出液电导率结果见表1。
 | 表1 采集卡样本保存区域的浸出液电导率结果（μS/cm） Table 1 Electric conductivity measured of the fluid immersed from the drenched storage area of collection card (μS/cm) |
2.1.2 结果分析
样本保存区域的浸出液电导率数据, 反映了样本保存区域的涂层情况。
6种口腔细胞样本采集卡中, 仅有1#、2#和3#的电导率较大（占比50%）, 其余电导率均≤10 μS/cm。推测这6种卡中, 仅有1#、2#和3#与其他卡的化学物质构成存在有明显差异。
12种血液样本采集卡中, 仅有7#和8#的电导率较大（占比17%）, 其余电导率均≤10 μS/cm。推测仅有7#和8#与其他卡的化学物质构成存在着明显差异。
2.2 PCR扩增效果
2.2.1 结果
加载人基因组DNA9947的采集卡, 经PCR扩增, 产物经毛细管电泳检测, 18种采集卡的STR基因座产物峰检出率均为100%, 结果见表2（0 min的样品）。
2.2.2 结果分析
不同采集卡的产物STR基因座产物峰检出率均为100%, 均能满足法医DNA数据库样本的STR检测要求。
2.3 紫外照射保护功能
2.3.1 结果
加载人基因组DNA9947的采集卡, 经过紫外光照射后, 洗脱的DNA经PCR扩增, 产物经毛细管电泳检测, 产物峰检出数和检出率结果见表2。
| 表2 产物峰检出数和检出率 Table 2 The quantity and rate of the peaks tested from the treated human genomic DNA 9947 |
2.3.2 结果分析
与不具备紫外照射保护功能的采集卡相比, 具备紫外照射保护功能的采集卡, 经过紫外线照射后, 产物检出率更高。与未经紫外照射的样品对比, 具有紫外照射防护功能的采集卡, 检出率仍能达到100%; 不具紫外照射保护功能的采集卡, 检出率则降低。6种口腔细胞样本采集卡中, 1#和2#具有紫外照射防护功能。12种血液样本采集卡中, 7#和8#具备紫外照射防护功能。
2.4 抑菌效果
2.4.1 结果
采集卡抑菌效果的结果见图1。其中标识的数字为采集卡编号, 标识的“ 阳性” 为阳性对照。
 | 图1 采集卡样品保存区域的微生物生长情况Fig.1 Microbial growth from the sample-storage areas of the collection cards |
2.4.2 结果分析
具备抑制黑曲霉生长功能的采集卡, 其表面无黑曲霉生长, 且圆形样品边缘清晰。阳性对照和无抑菌效果的采集卡, 其表面有黑曲霉生长, 边缘模糊（黑曲霉生长超出样品边缘）。6种口腔细胞样本采集卡中, 仅有1#和2#两种具备抑菌能力。12种血液样本采集卡中, 仅有7#和8#两种具备抑菌能力。
3 讨论
DNA检验与数据库工作对样本DNA的要求, 主要包括两个方面：一是PCR扩增效果; 二是DNA能够长期稳定保存。本研究发现多数现在使用的口腔细胞和/或血液样本采集卡这两项功能不足。
对于DNA检验来说, 收集的样本要长期保存, 就必须克服样本DNA降解的问题。自然界中, 样本DNA的降解有赖于两个机制：一是生物降解, 二是化学降解。生物降解是因为被采集细胞样本中含有微生物, 空气中是以霉菌孢子类微生物为代表, 当温湿度高时, 它们迅速繁殖, 从而降解样本的DNA[3]。在我国南方夏季, 没有抑菌功能的采集卡会在短期内长出大量的霉菌菌丝。相对于生物降解, 化学降解就更难避免, 正如本文所显示的, 在采集卡保管与防护不佳的环境下, 短时间的紫外照射就会对DNA造成毁灭性的损害。因此, 紫外照射防护对于样本中DNA的长期保存是必要的。
为了减少生物降解, 采集卡应包含抑菌成分, 能够破坏细菌或真菌的细胞膜或病毒的蛋白质外壳, 从而损伤细胞或病毒的结构, 达到灭活真菌、细菌和病毒或抑制其生长的作用[4]。这些化学物质对PCR扩增具有双重影响, 一方面它们具有抑制PCR扩增效果的作用; 另一方面, 由于抑制微生物的生长却又可以对加载在采集卡上的细胞提供一个良好的保存环境, 同时还具有裂解细胞的功能, 能增加PCR扩增的起始模板量, 对PCR扩增可起促进作用[5]。近年来, 随着PCR试剂抗抑制能力的提升, 很多PCR试剂能够有效拮抗采集卡上化学物质对PCR的抑制作用。本文中, 使用一级水将采集卡上的DNA洗脱下来, 减少引入PCR体系中的化学物质的量, 降低化学物质对PCR的影响, 就从反面较好地反映了采集卡保存DNA的实际情况。
此外, 为了考察采集卡长期保存样本的稳定性, 需要进一步测试不同生产厂家的采集卡在长期保存真实样本时其各项性能指标情况。
综上论述, 为了确保法医DNA检验的成功与数据库建设工作的长期、顺利开展, 本文建议采用经过产品质量检测后具有抑菌和紫外照射防护功能的采集卡, 如此, 既可以满足STR分型检验工作, 又便利于对采集到的生物样本长期保存, 有益于案件复检需要。
参考文献
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