目前, 血醇气相色谱检测方法可分为单柱和双柱毛细管色谱分离系统, 所使用的色谱柱有PLOT Q、PEG-20M、DB-ALC1和DB-ALC2等^[4]。单柱系统采用了一根色谱柱来对样品进行分析, 具有分离效果好、峰形好、准确度高、精确度好和使用简便等特点。但是对于复杂的血液基质检材来说, 采用单根色谱柱分析时会不可避免地存在组分样品的共流出现象, 或者由于组分保留时间相近而带来的组分识别问题、干扰问题和定量分析等问题。而双柱系统由于采用了两根极性不同的色谱柱, 因此组分在这两根色谱柱上的出峰次序有所不同, 从而避免了组分干扰和组分共流出所带来的分离问题, 同时通过相互对照和分别计算各组分的浓度, 就能完全弥补单柱色谱分离系统的不足, 减少误差, 提高乙醇检测结果的准确度^[5]。

内标法与外标法都是血醇检测常用的定量方法, 外标法检测时间短、检材用量少, 适合大量血液样品的分析检测, 但对操作条件及进样量控制较严格^[6], 而内标法能在一定程度上消除操作条件变化（如进样量减少）而引起的误差, 具有更高的准确度, 在血醇检测中常常被采用。在内标分析方法中, 为了消除组分基质效应对分析结果的干扰因素, 一般选用具有与乙醇化学性质相近的物质作为内标物。常用作内标物的物质主要有异丙醇、叔丁醇、1, 4-二氧六环和正丙醇等^{[4, 5, 7, 8]}。以正丙醇为内标物时乙醇的测定值比叔丁醇更接近理论值, 而且其相对响应系数和回归曲线的斜率更高^[5]; 在冬天或实验室温度条件控制不理想时, 由于叔丁醇的熔点（25~26 ℃）相对较高, 容易在溶液中析出, 因此选用熔点较低的异丙醇（-89 ℃）结果更加准确; 在腐败血样检测中, 通常是用正丙醇的浓度计算腐败生成乙醇的浓度, 所以常选用1, 4-二氧六环^[7]、异丙醇等作为内标物; 另外, 在酸性条件下叔丁醇容易与乙酸发生酯化反应^[8], 因而会造成乙醇检测含量的偏差, 因此采用正丙醇作为乙醇分析的内标物更好。

血醇检测常采用直接进样或顶空进样的分析方式。直接进样法操作简便、重现性好, 具有可靠性, 可用于全血检材^[9]。但是, 直接进样会因血液中的蛋白阻塞色谱柱和进样器, 从而导致色谱柱使用寿命缩短, 而顶空进样法能够消除蛋白等基质对色谱柱和仪器可能造成的污染, 因此不仅简化了样品前处理过程, 而且提高了血醇检测结果的准确度^[10]。

血液采集时如果使用含乙醇类消毒剂, 在消毒剂未挥发前进行采血则容易造成被检测者血液中的乙醇浓度值异常升高^[11]。2010年, Malingre等^[12]使用单盲法对含乙醇消毒剂可能带来的误差进行了考察, 通过分析50名12岁以下的儿童和20名健康的成年人血液样本中乙醇的浓度, 发现使用消毒剂处理皮肤表面后的血液样本中均未检测到乙醇（检出限为0.02 mg/mL）。2015年杜鹃等^[13]对比分析了采血过程中可能的误差来源, 认为检材中乙醇含量升高的来源是按压针头的棉签。按压棉签中含有高浓度的乙醇, 在拔针时乙醇能够从创口位置顺着针头进入血液, 从而造成了血液样本的污染, 而消毒剂中乙醇对血液样本中乙醇的分析不会造成任何干扰。

活体血液样本采集部位一般是选择体表浅静脉, 尸体血液采集需要根据尸体完整状态的差异, 选用相应的部位采取样本, 同时血醇的浓度也会因为采集部位不同存在一定的差别。Pounder等^[14]通过乙醇胃管灌注实验发现, 人死后乙醇会从食道或胃内由血液向不同组织部位进行弥散。其中, 心包腔内液体中的乙醇含量最高, 其浓度高于其他部位的2~3倍, 而后左肺静脉血、主动脉、左心室、肺动脉、上腔静脉血、下腔静脉血、右心静脉、右肺静脉、股静脉等依次降低。因此, 在死亡案件中为了避免乙醇弥散所带来的干扰, 应首选股静脉或锁骨下静脉血液采集; 对于损伤严重或残缺的尸体, 在无法提取到股静脉或锁骨下静脉血液时, 则选择心腔血液。心腔血液提取时尽量避免使用胸外穿刺的方法, 以防血液样本被胃中的内容物所污染; 此时还应注意, 尽量使心腔内的血液混合均匀, 避免由于红细胞比容过高或过低而影响血醇检测结果^[15]。

另外, 尿液、唾液、玻璃体液和呼出气体等也可以作为血醇分析的检材。这些检材中乙醇的浓度与血液检材中乙醇的浓度具有一定的关联性。饮用白酒2~5 min后乙醇开始进入血液, 约1.5 h后血液中乙醇的浓度达到最高值, 6~13 h各器官的含量达到最高值^[11]。乙醇在人体中达到动态平衡后, 血液中乙醇的浓度约是唾液中的0.93倍、呼出气体的2 100倍、尿液的0.71~0.83倍^[16], 因此, 可以通过分析这些检材来辅助确认血醇检测结果的准确性。另外, 还可以根据乙醇在体内的吸收和分布特点, 结合血液与组织、体液或呼气中乙醇的关系（如表1）来推断血醇分析的准确性。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 血液与组织、其他体液及呼气中乙醇含量关系 Table 1 Relationship between ethanol concentrations from blood, tissue, other humors or exhalation 样品 相对含量/(mg/mL) 全血 1.00 血浆 1.10~1.15 血清 1.35~1.90 肝组织 1.48 脑组织 1.75 脊髓 1.50 玻璃体液 0.89~1.12 关节囊滑液 1.30 臀部肌肉 0.74~0.94 尿液 1.20~1.40 呼气 4.36×10-4~4.76×10-4

表1 血液与组织、其他体液及呼气中乙醇含量关系 Table 1 Relationship between ethanol concentrations from blood, tissue, other humors or exhalation

刘冬娴等^[17]探讨了常用的7种储存容器对乙醇含量检测结果的影响作用。研究表明对于同一种血样选用不同的容器储存时, 乙醇测定的结果存在一定的差别, 使用EDTA-K2抗凝剂的储存容器中血醇分析的准确度更高, 且血醇浓度按照分离胶-促凝剂管> 促凝剂管> 无抗凝剂管> EDTA-K2管> 枸橼酸钠（1:9）管> 枸橼酸钠（1:4）管的次序依次降低, 柠檬酸钠（9:1）管与枸橼酸钠（1:9）检测结果基本一致。在此后对普通采血管、真空普通管、真空抗凝管等储存容器的比较研究表明, 真空抗凝管是血醇检材存储的最佳容器^[18]。另外, 血液状态不同时, 其血清、血浆与全血中的乙醇含量也不一致。抗凝不良的血液标本中, 血清比全血中的乙醇浓度高, 血浆比全血中乙醇浓度低, 差异有统计学意义^[19]。王修全等^[20]研究发现储存容器的摆放方式对乙醇含量分析也有一定影响, 水平放置的血浆中乙醇浓度与直立放置相比较有明显下降, 而血清中乙醇浓度值无明显变化, 但是该研究并未对乙醇浓度差别的原因做出进一步的分析。

检材在存储过程中, 会因存储温度和存储时间不同而发生不同程度的氧化、挥发和微生物降解等问题, 从而会造成血醇检测结果的误差增大, 因此, 血醇检材在存储时必须加入一定的防腐剂并在较低温度下保存。常温保存的检材中血醇浓度会明显升高, 而添加了防腐剂（浓度为1%）且4~8 ℃的存储温度条件下, 血液检材可稳定保存7~10 d; 在-20 ℃的冷冻条件下可以延长检材的保存时间到35 d左右^{[21, 22]}。但是值得注意的是, 在冷冻存储条件下, 存储容器对检材的稳定性也具有显著的影响作用。在常见的存储容器中, EDTA-K2储存管的使用效果最好, 在冷冻保存49 d后血样无显著性变化^[22]; 保存60~120 d后乙醇的浓度会有不同程度的下降, 约在3.42%~59.4%之间。乙醇浓度下降的比例与其浓度有关, 浓度越大下降比例越大^[23]; 另外, 对于冷冻保存的检材, 在分析时应该充分解冻后才能进行分析, 其解冻时间应不低于1.5 h^[24]。

人体中乙醇的消除过程与乙醇在人体中的吸收和代谢有关, 人的年龄、性别、体重、饮酒习惯和居住地区等因素虽然使得血醇消除过程表现出了个体特征, 但是乙醇的消除过程也表现出了一定的规律性^[25]。乙醇在人体中的消除速率约为10 mg/(100 mL· h)^[26], 随着年龄的增长, 饮酒后血醇的代谢速率会逐步变慢, 因此, 青年人血醇浓度达到最大值的时间要小于老年人^[27]; 但是乙醇的消除速率却表现出与年龄无显著相关, 而与性别、体重中度相关的特点^[28], 男性的消除速率明显快于女性, 体重越重消除速率越大。乙醇的消除规律对于涉酒逃逸案件具有重要作用, 能够为追溯肇事原因和推断肇事时司机的血醇含量提供科学依据。

白酒中除含有大量乙醇外, 还同时含有种类繁多的乙醇同源化合物, 如甲醇、正丙醇、丁醇、异戊醇等微量成分。这些物质不仅具有相似的化学结构, 而且与乙醇具有相似的代谢和药代动力学特点。在法医物证鉴定中, 能够通过测定乙醇及其同源化合物的含量和相对浓度来判断饮酒时间和死亡时间。但是, 这些物质同时也是酒精饮料的组成成分和代谢成分, 因此, 这就对血醇分析气相色谱方法提出了更高的要求。双柱/双FID色谱分析系统^[5]在乙醇及其同源化合物分析中具有突出的分析和使用优点。

Widmark公式^[2]给出了部分同源化合物的吸收及消除的代谢动力学计算方法。根据乙醇及其同源化合物的代谢规律和它们的测量值可以帮助推算出真正的饮酒时间（目前仅适用于饮酒后1~3 h之内）。该公式表达为：

C₀=A/(W×r)

其中, C₀表示预期血液中组分的质量浓度, mg/kg;A表示饮入量, mg;W为体重, kg; r表示常数, 与同源化合物的种类有关。该公式在计算不同时间间隔时的具体表达式及测量标准误差如表2^[29]。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 常见乙醇同源化合物预期血液浓度计算公式及标准误差[29] Table 2 Calculation formulas and their standard errors for expected blood concentrations of alcoholic congeners 醇类 r常数值（中值） 计算公式 标准误差 甲醇 0.6~0.8(0.7) C30=0.79×C0+0.01 C90=0.89×C0+0.08 C150=0.95×C0+0.16 ±0.58 ±0.44 ±0.28 正丙醇 0.6~0.8(0.7) C30=0.72×C0 C90=0.59×C0+0.01 C150=0.48×C0+0.01 ±0.05 ±0.07 ±0.12 异丁醇 1.1~1.5(1.3) C30=0.56×C0+0.03±0.11 C90=0.40×C0+0.03 C150=0.30×C0 ±0.12 ±0.09 ±0.04 3-甲基-1-丁醇 1.6~2.4(2.0) C30=0.32×C0 C90=0.15×C0 C150=0.07×C0 ±0.05 ±0.04 ±0.06 注：C30、C90、 C150分别为饮酒结束后30、90、150 min时预期乙醇同源化合物血液质量浓度

表2 常见乙醇同源化合物预期血液浓度计算公式及标准误差[29] Table 2 Calculation formulas and their standard errors for expected blood concentrations of alcoholic congeners

腐败尸体中乙醇的生成不仅与尸体的腐败过程有关, 而且还与死者生前患有的疾病和损伤有关。败血症、高血糖、腹部损伤和撕裂伤等都可能导致人体死后产生大量乙醇^[11]。高糖血腐败产生乙醇的速度比正常血快, 而且浓度高^[37]; 高糖血腐败最快4 d即可产生乙醇, 而正常血最快8 d才能够产生乙醇。尸体生前存在损伤合并感染时, 体内已有大量细菌繁殖, 这会进一步加快尸体腐败, 从而导致尸体血液中的乙醇含量异常升高; 但是滋生的腐败细菌还可能分解血液中的乙醇, 使血液中乙醇含量再次降低。因此, 对于腐败尸体中的血醇进行检测分析时, 应考虑疾病和损伤带来的干扰因素。

根据尸体中乙醇产生的特征规律, 在空气流动、湿度处于正常值等一般条件下, 尸体中乙醇的产生主要受温度影响。低于5 ℃时, 乙醇一周之后才有可能生成; 5~20 ℃, 48 h就明显产生; 20 ℃以上, 24 h就能产生乙醇。另外, 尸体中的乙醇还存在弥散现象, 随着腐败时间的延长, 腐败产生的乙醇会由浓度较高的人体组织向浓度低的组织弥散, 这就为确定生前的血醇浓度带来一定困难。但是, 尸体内乙醇的弥散具有一定的时间依赖性, 一般在24 ~48 h后才发生弥散现象。

尸体内乙醇的弥散速率与酒精饮料的种类和饮料中乙醇的含量有关, 且在弥散过程中会因微生物分解、酶降解、水分蒸发等原因导致乙醇含量降低。这些变化以及不同组织中乙醇的弥散遵循何种规律, 目前并未有明确的研究结论, 因此仍然需要通过分析腐败尸体中的血醇分布规律, 去探究腐败时间的影响作用。