引用本文
林葭, 曾文灿, 李航麒, 叶树海, 庄顺, 林坚. 高效液相色谱-飞行时间质谱法检测人血中的丁醚脲及其代谢产物[J].刑事技术, 2021,46(5):497-501
LIN Jia, ZENG Wencan, LI Hangqi, YE Shuhai, ZHUANG Shun, LIN Jian. Detection of Blood-harbored Diafenthiuron and Metabolic Residues with Liquid Chromatography-quadrupole Time-of-flight Mass Spectrometry[J]. Forensic Science and Technology,2021,46(5): 497-501  
Doi: 10.16467/j.1008-3650.2021.0126
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《刑事技术》编辑部
高效液相色谱-飞行时间质谱法检测人血中的丁醚脲及其代谢产物
林葭1, 曾文灿2, 李航麒1, 叶树海1, 庄顺1, 林坚1
1.福建省公安厅刑事技术总队,福州 350001
2.福建省测试技术研究所,福州 350001

第一作者简介：林葭,女,福建福州人,博士,高级工程师,研究方向为刑事技术理化检验。E-mail:12645923@qq.com

收稿日期: 2020-09-29 修回日期: 2021-03-16
摘要

目的 建立人血中丁醚脲及其代谢产物丁醚脲-脲和丁醚脲-甲烷亚胺的高效液相色谱-飞行时间质谱联用（HPLC-QTOF/MS）分析方法。方法 取人血2mL,用2mL 乙腈沉淀蛋白,选用Kinelex® Cl8（2.6μm 3.0mm×100mm）色谱柱,以0.1％甲酸+乙腈（A相）和5mmol/L 甲酸铵溶液+0.1%甲酸溶液（B相）为流动相梯度洗脱分离,采用液相色谱-飞行时间质谱仪的电喷雾电离,正离子模式进行分析。结果 该方法人血中的丁醚脲、丁醚脲-脲和丁醚脲-甲烷亚胺检出限分别为1.0、0.1、1.0 ng/mL;丁醚脲、丁醚脲-脲、丁醚脲-甲烷亚胺在0.5~100ng/mL范围内线性良好 ( R2=0.9991~0.9996),在3个浓度水平平均回收率为78.1%~98.5%,日内精密度为4.1%~5.5%,日间精密度为5.5%~9.0% 。结论 该方法样品前处理方法操作简便,专属性强、灵敏度较高,适用于人血中丁醚脲及其代谢产物的定性定量。

关键词: 法医毒物学; 丁醚脲; 血液; 高效液相色谱-飞行时间质谱
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2021)05-0497-05
Detection of Blood-harbored Diafenthiuron and Metabolic Residues with Liquid Chromatography-quadrupole Time-of-flight Mass Spectrometry
LIN Jia1, ZENG Wencan2, LI Hangqi1, YE Shuhai1, ZHUANG Shun1, LIN Jian1
1. Forensic Science Division of Fujian Provincial Public Security Department, Fuzhou 350001, China
2. Fujian Institute of Testing Technology, Fuzhou 350001, China
Abstract

Objective To establish a method for analysis of diafenthiuron and its metabolic residues in blood with liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry (LC-QTOF/MS).Methods The blood sample (2.0mL) was extracted with acetonitrile (2.0mL) to precipitate protein, having its well-treated supernatant subjected to chromatographic separation on a Kinetex® 2.6μm C18 analytical column (100mm ×2.1mm) through which the gradient elution was run with the mobile phases consisting of 0.1% formic acid plus acetonitrile (mobile phase A) and water containing 20mM ammonium formate plus 0.1% formic acid (mobile phase B). The MS analysis was conducted with HPLC-QTOF/MS under the conditions of electrospraying positive ionization mode (ESI+).Results Diafenthiuron and its metabolites, diafenthiuron-methanimidamide and diafenthiuron-urea, delivered their respective limit of detection in each spiked blood as 1.0ng/mL, 0.1ng/mL and 1.0ng/mL, demonstrating their calibration curves being linear within the range of 0.5~100ng/mL ( R2=0.9991~0.9996), average recoveries spiked at three-level concentrations spanning among 78.1%~98.5%, and the inter- and intra-day precision falling into 4.1%~5.5% and 5.5%~9.0%, respectively.Conclusion The here-established method is simple, rapid, sensitive and specific, appropriate for identification and quantification of diafenthiuron and its metabolite residues in blood.

Key words: forensic toxicology; diafenthiuron; blood; HPLC-QTOF/MS

丁醚脲（diafenthiuron）是一种新型硫脲杀虫杀螨剂, 具有触杀、胃毒、内吸等作用, 广泛应用于水果、蔬菜、棉花和茶树上防治蚜虫、叶蝉、粉虱以及螨虫等[1, 2, 3], 它通过影响昆虫呼吸作用、干扰能量转换和转化为具有更高毒性的代谢产物达到杀虫目的。丁醚脲在光解、水解、环境微生物降解以及植物体内降解的主要产物为丁醚脲-甲烷亚胺、丁醚脲-脲等[4]（见图1）。最新研究表明, 丁醚脲对蜜蜂具有一定毒性[5], 丁醚脲代谢物比丁醚脲原药本身具有更高的毒性, 因此2002年欧盟颁布的第2076/2002号法规规定对丁醚脲实行本地区内禁用、禁售[6]。2020年, 国内发生多起使用丁醚脲投毒和自杀的案件, 目前, 有关人血液中丁醚脲及其代谢物测定方法未见报道。本文建立了血液中丁醚脲及其代谢物的高效液相色谱质谱联用方法（HPLC-QTOF/MS）, 并应用于实际案件的检测中。该方法灵敏度高, 专属性强, 适用于法庭科学中丁醚脲及其代谢物的检验鉴定。

图1 丁醚脲降解为丁醚脲-脲和丁醚脲-甲烷亚胺Fig.1 The postulated pathway for diafenthiuron to degrade

1 材料与方法
1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 1290 超高效液相色谱仪-6520四级杆串联飞行时间质谱仪（美国Agilent公司）, 丁醚脲、丁醚脲-甲烷亚胺、丁醚脲-脲（ 美国sigma-Aldrich 公司）; 乙酸乙酯、甲醇、乙腈（色谱纯, 德国Merck 公司）, 甲酸、甲酸铵（分析纯, 美国Tedia 公司）、水（法国Millipore 超纯水系统制得）。血液样本取自本实验室近期未服药的健康人员。

1.2 色谱条件

选用Kinelex® Cl8（3.0 mm×100 mm, 2.6 μm）色谱柱; 柱温：30 ℃; 流动相A：0.1％甲酸+乙腈, 流动相B：5 mmol/L 甲酸铵溶液+0.1%甲酸溶液; 进样量2 μL; 流速为0.3 mL/min梯度洗脱, 梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱条件 Table 1 Gradient elution conditions
1.3 质谱条件

离子源：ESI; 扫描方式：正离子全扫描; 全扫描范围：m/z 50~1 700, 毛细管电压：4 000 V; 毛细管电压：130 V, 锥孔电压：60 V; 氮气, 气体温度：350 ℃, 干燥气流速：8 L/min, 喷雾器压力：35 psi; 碎裂电压：175 V。

1.4 样品前处理

丁醚脲中毒案件中死者血液2 mL, 置于15 mL具塞管中, 加入2 mL乙腈, 振荡3 min, 超声3 min, 8 000 r/min离心5 min, 取上层清液过0.22 μm有机微孔滤膜于试管中, 60 ℃氮吹至近干, 用1 mL乙腈溶液定容, 取0.1 mL定容溶液于有内衬管的棕色进样瓶中。

1.5 标准曲线

在空白血中分别加入不同量的丁醚脲、丁醚脲-甲烷亚胺、丁醚脲-脲标准溶液, 配制成0.5、1、2、5、10、20、50、100 ng/mL的丁醚脲、丁醚脲-甲烷亚胺、丁醚脲-脲血液样品, 并按照1.4法处理后进样。以待测物浓度为横坐标, 待测物的峰面积为纵坐标, 进行回归运算, 求得直线回归方程, 即为标准曲线。

2 结果与讨论
2.1 选择性

分别测定20 ng/mL丁醚脲、丁醚脲-甲烷亚胺、丁醚脲-脲的空白血液添加标准品溶液, 各组分的保留时间、精确分子质量、理论分子质量和质量误差见表2, 各组分的提取离子流色谱图及质谱图见图2。

表2 丁醚脲及其代谢产物的检测参数 Table 2 Mass spectrum parameters of diafenthiuron and its metabolite residues

图2 空白血液添加丁醚脲及其代谢产物标准EIC色谱图（a.丁醚脲; b.丁醚脲-甲烷亚胺; c. 丁醚脲-脲）及质谱图（d.丁醚脲; e.丁醚脲-甲烷亚胺; f. 丁醚脲-脲）Fig.2 Chromatograms of the extracted ions (a. diafenthiuron; b. diafenthiuron-methanimidamide; c. diafenthiuron-urea) and extracted mass spectra (d. diafenthiuron; e. diafenthiuron-methanimidamide; f. diafenthiuron-urea) from blank blood spiked with the reference standards of diafenthiuron and its metabolite residues

将无丁醚脲及其代谢物接触史的健康人血液2 mL作为基质, 按照1.4法处理后进样。在目标物的位置无响应, 说明空白基质无干扰, 方法选择性良好。

2.2 线性方程、检测限（LOD）和定量限（LOQ）

本研究血液中的丁醚脲、丁醚脲-脲、丁醚脲-甲烷亚胺在0.5~100.0 ng/mL范围内线性良好, 线性回归方程分别为y=2×106x+40 958（R2=0.999 1）、y=107x +148 437（R2=0.999 6）、y=107x -28 874（R2=0.999 1）。本方法确定的丁醚脲、丁醚脲-脲、丁醚脲-甲烷亚胺的LOD分别为1.0、0.1、1.0 ng/mL, LOQ均为5.0 ng/mL, 可以满足法医毒物分析工作的需要。

2.3 准确度和精密度

分别在空白血液中添加1、10、100 ng/mL丁醚脲、丁醚脲-脲、丁醚脲-甲烷亚胺标准品, 配制成低、中、高3个浓度水平的质控样品。每天取各浓度水平的样品6个进行测定, 连续4 d, 计算日内和日间测定的准确度及精密度。准确度为测定平均值与参照值的百分比, 计算丁醚脲、丁醚脲-脲、丁醚脲-甲烷亚胺峰面积的相对标准偏差（RSD）作为日内精密度, 再重复3 d, 计算RSD值作为日间精密度（见表3）。方法的日间及日内精密度均小于10%, 准确度为89.0%~101.1%。

表3 方法的准确度、精密度、基质效应和提取回收率 Table 3 Accuracies, precisions, matrix effects and recoveries
2.4 基质效应和回收率

丁醚脲、丁醚脲-脲、丁醚脲-甲烷亚胺分别制备1、10、100 ng/mL 3个浓度的控制样品, 每个浓度6份, 按照1.4法处理后进样, 测得目标物的峰面积为A1。空白血液经1.4法处理后, 加入丁醚脲、丁醚脲-脲、丁醚脲-甲烷亚胺, 制成相应浓度的溶液, 测得其峰面积为A2。提取回收率=A1/A2×100%。另取相同量的对照品溶液, 测得丁醚脲、丁醚脲-脲、丁醚脲-甲烷亚胺的峰面积为A3。基质效应=A2/A3×100%。由表3可见丁醚脲、丁醚脲-脲、丁醚脲-甲烷亚胺的提取回收率均在75%以上, 说明丁醚脲、丁醚脲-脲、丁醚脲-甲烷亚胺在样品前处理过程中损失较少。

2.5 案例应用

2020年6月福建省漳州市发生了一起造成两死两伤的投毒案件, 运用所建立的方法, 从其中一名死者在医院仅存的3 mL血液中检出了丁醚脲、丁醚脲-脲、丁醚脲-甲烷亚胺, 该死者血液中出现与丁醚脲、丁醚脲-脲、丁醚脲-甲烷亚胺标准保留时间相同（保留时间偏差在±0.1%之内）, 定性分析精确质量数相同的色谱峰, 且空白尿液无干扰, 浓度分别为0.12、1、0.02 μg/mL（图4）。该检验结果与嫌疑人的供述一致。

图4 死者血液中丁醚脲及其代谢产物的EIC 色谱图（a.丁醚脲; b.丁醚脲-甲烷亚胺; c. 丁醚脲-脲）Fig.4 Extracted ion chromatograms (EIC) of diafenthiuron and its metabolite residues from the cadaver's blood (a. diafenthiuron; b. diafenthiuron-methanimidamide; c. diafenthiuron-urea)

3 结论

本文采用乙腈提取-高效液相色谱串联飞行时间质谱方法, 建立了一种血液中丁醚脲、丁醚脲-脲、丁醚脲-甲烷亚胺的分析方法。实验结果表明该方法具有较高的排除基质干扰能力以及灵敏度优势, 完全能满足司法鉴定实践中对血液中丁醚脲、丁醚脲-脲、丁醚脲-甲烷亚胺的分析。

参考文献
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