早期选用miRNA进行体液鉴定的研究者对内参基因的重要性认识不足, 选择方法和标准不够严谨, 研究中使用的内参基因相对单一。2009年Hanson等^[13]应用SYBR Green qPCR首次推断体液鉴定miRNA组时, 依据基因表达的高丰度、稳定性和有效性的特点, 选择U6b作为5种体液（外周血、月经血、唾液、精液、阴道分泌液）的归一化参照。2011年Court和Madea^[14]应用SYBR Green qPCR验证微阵列筛选的外周血和唾液特异性标记, 以及2013年Bai等^[15]应用SYBR Green qPCR验证前人报道的8个体液miRNA标记, 均选择U6b作为相对定量的归一化参照。然而, 这些研究中对于U6b作为内参基因的归一化能力并没有作进一步说明。

为了量化候选内参的归一化水平, 以比较其稳定性差异, 研究者采用实验验证与软件分析相结合的方法择优筛选内参基因。2013年Wang等^[16]应用TaqMan qPCR验证了4个文献报道的内参基因:RNU44、RNU48、U6b和U6, 并使用BestKeeper软件评估其表达稳定性。根据每种体液10个样本, 共计50个样本的结果显示, 与U6相比, RNU44、RNU48和U6b在不同体液中表达不够稳定, 且单因素方差分析表明, U6在5种体液中表达差异无统计学意义, 因此更适宜作为内参基因。

针对单个内参基因归一化效果不理想的情况, 许多研究认为将多个内参基因进行组合在理论上可提高归一化的准确性。

2010年Zubakov等^[17]应用微阵列筛选5种体液的标记物时, 认为RNU24、RNU44和RNU48在每个样本中显示了相似的表达水平, 且与样本类型无关, 因此将这3个基因作为TaqMan qPCR检测的内参组合。然而, 该研究并未提及这些内参基因的具体表达量, 也并未分析各个基因的稳定性情况, 因此无法得知该研究中内参基因的归一化水平。

2014年Sauer等^[8]应用TaqMan qPCR验证了13个文献报道的内参基因, 并采用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3种软件综合评估其表达稳定性。根据5种体液单个样本、同种体液不同个体混合样本以及5种体液间混合样本的实验结果, SNORD24（RNU24）、SNORD38B（RNU38B）和SNORD43（RNU43）为最佳内参组合, 因其表现出最稳定的表达水平和最小的预期变异。该研究因SNORD44（RNU44）扩增效率较低（61%）, SNORD48（RNU48）存在非特异性扩增, 故将二者排除在分析之外。然而, 这些候选内参中并不包含U6, 因此无法比较U6与内参组合的归一化水平高低。

2015年Sirker等^[18]应用TaqMan qPCR验证了10个文献报道的内参基因, 并使用geNorm软件确定miR-92和miR-374作为内参组合。

2017年Sirker等^[19]试图使用miR-26b、miR-92、miR-144和miR-484的内参组合进行归一化改进。然而, 选用过多内参会增加实际应用的复杂性, 且这些研究中对于多个内参归一化的一致性缺乏合理解释, 因此仍需进一步讨论。

鉴于越来越多的研究推荐使用组合内参, 一些研究试图对单个内参和组合内参的归一化能力进行比较评价。

2015年Sirker等^[18]应用TaqMan qPCR对U6b与内参组合miR-92和miR-374进行了归一化比较评价。然而, 两组内参的归一化效果各异。如对miR-16在不同体液样本中的表达情况进行分析时, 使用U6b作为内参能够区分出血液与非血液样本, 使用内参组合则无法区分; 在对miR-203进行分析时, 则是适用内参组合而不是U6b; 对于miR-451, 虽然内参组合和U6b都能够区分出血液和非血液样本, 但归一化后的数值相差极大。

2018年Fujimoto等^[20]应用添加锁核酸（locked nucleic acid, LNA）的SYBR Green qPCR评估了11个候选基因作为内参基因的可行性, 并在使用NormFinder和BestKeeper软件之外, 追加使用R软件中的RankAggreg包对候选基因进行排名计算, 试图对内参基因归一化的一致性进行相关解释, 以确定最佳的单个内参和组合内参。该研究认为, 5S rRNA为单个最佳内参, 且优于常用内参U6; 使用5S rRNA与miR-92a-3p和/或miR-484进行组合可进一步提高归一化质量。

微阵列（microarray）是目前广泛应用的高通量miRNA检测技术。其利用芯片上固定的已知序列探针与待测样本进行核酸杂交, 通过相应位置的荧光信号反映特定miRNA的表达丰度^[21]。微阵列可同时并行检测数百个miRNA, 多用于miRNA的初筛, 在法医体液相关标志物的筛选中应用较广。

随着下一代测序(next-generation sequencing, NGS)的发展, 通量更高、数量更多的高效率检测已被广泛应用于各个领域。应用small RNA-seq等技术可对特定样本中的miRNA进行深度测序, 直接反映出目的miRNA的含量。NGS还可发现新的miRNA,
并根据研究需求实现miRNA的筛选及表达谱检测^[22]。尽管目前在体液鉴定中应用NGS技术筛选稳定表达miRNA的报道较少, 但该方法在理论上具有可行性。然而, 高通量检测对miRNA的质量和完整性要求很高^[6], 且测序费用高, 数据分析、处理复杂, 具有一定的限制性。

高通量筛选虽全面有效, 但只是反映特定样本中整体的基因表达趋势, 因此筛选结果仍需进行实验验证。qPCR灵敏度更高、特异性更优, 可同时检测多个样本中有限数量基因的表达水平, 适用于高通量筛选结果的验证。

目前法医学miRNA相关检测主要应用SYBR Green qPCR与TaqMan qPCR两种方法^[23]。应用SYBR Green qPCR的优势在于经济便捷、模板通用性好; 而应用TaqMan qPCR可实现探针与靶序列的特异性结合, 提高检测的准确度^[24]。

扩增效率（PCR efficiency）是qPCR实验优化程度以及重复性好坏的重要指标^[25]。内参基因作为相对定量的内部参照, 其扩增效率的细微差别将导致目的基因相对表达倍率的较大差异。

目前较常用的扩增效率评估方法是基于qPCR构建标准曲线, 即将内参基因标准品或是样本RNA逆转录为cDNA, 进行一系列的等浓度梯度稀释, 利用qPCR构建平均Ct值与稀释倍数对数值之间的线性关系, 从而计算扩增效率大小。大多数研究认为相对定量中目的基因与内参基因的扩增效率应皆处于90%~105%之间。

由于候选内参的比较过程中并无其他归一化参照, 因此对qPCR数据的准确解释与评估至关重要。对此, 许多研究者提出了衡量候选基因表达稳定性的方法, 如geNorm^[26]、NormFinder^[27]和BestKeeper^[28]软件。

geNorm和NormFinder要求对每个候选内参的相对表达值进行比较, 即以2-Δ Ct的形式进行基因内归一化, 通过计算各个基因的稳定性值来确定恰当的内参。然而, geNorm通过两两比较, 可确定给定基因集中最适内参的数量, 并选出两个或两个以上的候选内参^{[11, 26]}; 而NormFinder考虑了样本的组内和组间差异, 并可确定唯一的最佳内参^{[9, 27]}。BestKeeper则要求将qPCR 3次重复的几何平均值作为输入数据, 按高相关性、低标准差、低变异系数的标准确定最优内参^[28]。BestKeeper不仅可用于评估候选内参的稳定性, 也可分析目的基因的表达情况, 但对基因和样本的数量有限制（目的基因和内参基因上限均为10, 样本上限为100）。