引用本文
蔡玉刚, 吴永富, 邹波, 王文, 张莲, 常靖. 快速溶剂萃取/液相色谱-串联质谱检测血液中的氟阿普唑仑[J].刑事技术, 2021,46(4):374-377
CAI Yugang, WU Yongfu, ZOU Bo, WANG Wen, ZHANG Lian, CHANG Jing. Rapid Solvent Extraction Coupling with LC-MS/MS to Determine Flualprazolam in Blood[J]. Forensic Science and Technology,2021,46(4): 374-377  
Doi: 10.16467/j.1008-3650.2021.0096
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快速溶剂萃取/液相色谱-串联质谱检测血液中的氟阿普唑仑
蔡玉刚1, 吴永富1, 邹波2, 王文3, 张莲3, 常靖2,*
1.泸州市公安局刑事科学技术研究所,四川 泸州646000
2.公安部物证鉴定中心,北京100038
3.四川警察学院,四川 泸州646000
* 通信作者简介:常靖,女,陕西米脂人,硕士,研究员,研究方向为法医毒物检验、法医毒理学。E-mail: changjing73@126.com

第一作者简介:蔡玉刚,男,四川遂宁人,学士,高级工程师,研究方向为理化检验。E-mail: 12721703@qq.com

收稿日期: 2020-06-01 修回日期: 2020-10-11
基金资助: 公安部现场物证溯源技术国家工程实验室开放性课题（2018NELKFKT 13）
摘要

目的 建立血液中氟阿普唑仑的高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）检验方法。方法 采用快速溶剂萃取（ASE）对血液检材中氟阿普唑仑进行提取,供高效液相-串联质谱检验。结果 在血液中氟阿普唑仑0.1~100ng/mL范围内,峰面积与浓度呈良好的线性关系,最低检出限为0.05ng/mL,定量限为0.1ng/mL,回收率为75.4%~95.3%。结论 该方法萃取速度快、操作简单、检出限低、回收率高和重现性好,适用于血液中氟阿普唑仑的检验。

关键词: 法医毒物学; 氟阿普唑仑; 血液检材; 快速溶剂萃取; 高效液相色谱-串联质谱
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2021)04-0374-04
Rapid Solvent Extraction Coupling with LC-MS/MS to Determine Flualprazolam in Blood
CAI Yugang1, WU Yongfu1, ZOU Bo2, WANG Wen3, ZHANG Lian3, CHANG Jing2,*
1. Luzhou Institute of Forensic Science, Luzhou 646000, Sichuan, China
2. Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing 100038, China
3. Sichuan Police College, Luzhou 646000, Sichuan, China
Abstract

Objective To establish an LC-MS/MS method for determination of flualprazolam in blood.Methods Automatic rapid solvent extraction (ASE) was adopted to extract flualprazolam in blood. The extracted chemical was subjected to analysis of LC-MS/MS.Results Good linear relationship was present with peak area among 0.1~100ng/mL of flualprazolam in blood, with the involving limit of detection (LOD) being 0.05ng/mL, limit of quantification as 0.1ng/mL, and recoveries within the range of 75.4%~95.3%.Conclusion This method is of fast extraction speed, simple operation, low detection limit, high recovery rate and good reproducibility, therefore suitable for determination of flualprazolam in blood.

Key words: forensic toxicology; flualprazolam; blood samples; ASE (automatic solvent extraction); HPLC-MS/MS

氟阿普唑仑(英文名:Flualprazolam, 又称氟代三唑仑, 化学名:1-甲基-8氯-6-（2-氟苯基）-4H-[1, 2, 4]三氮唑[4, 3-a][1, 4]苯并二氮卓, CAS号:28910-91-0, 分子质量:327.0, 分子式:C17H12ClFN4, 结构式见图1, 系新型苯二氮卓类策划药。苯二氮卓类药物作用于中枢神经系统的苯二氮卓受体(BZR), 加强中枢抑制性神经递质γ -氨基丁酸(GABA)与GABA受体的结合, 促进氯通道开放, 使细胞超极化, 增强GABA神经元所介导的突触抑制, 使神经元的兴奋性降低, 可引起中枢神经系统不同部位的抑制[1]。根据摄入量的大小, 临床表现可自轻度的镇静到催眠甚至昏迷。现阶段, 该药物未被列入国家管控目录, 在网络平台公开售卖, 被不法分子用于麻醉抢劫、麻醉强奸, 少量见于药物依赖和自杀[2]。

图1 氟阿普唑仑分子结构Fig.1 Molecular structure of flualprazolam

目前, 据少量国外文献报道[3], 对氟阿普唑仑的主要检验方法有气质联用法（GC-MS）、液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱法（HPLC-QTOF）和核磁共振法（NMR）, 尚未见液相色谱-三重四极杆串联质谱（LC-MS/MS）检验方法的报道。由于设计型药物标准品生产和录入标准质谱库时间相对滞后, 在实验室检测过程中容易漏检。本文对氟阿普唑仑的LC-MS/MS检验方法进行研究, 供检验从业者参考。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

1290-6470型高效液相色谱– 三重四极杆质谱仪（美国Agilent公司）; Dionex ASE350型快速溶剂萃取仪（美国 Thermo Fisher Scientific公司）; CV600冷冻真空浓缩仪（北京吉艾姆公司）; AL204-IC分析天平（瑞士Metlle Toledo公司）; Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）; IKA涡旋振荡仪（德国IKA公司）; 滤膜型号:Nylon Single Membrane; φ 13; 0.22 μ m（美国 Waters公司）。

氟阿普唑仑（纯度99.5%, 中国国家毒品实验室）, 甲醇、乙腈（色谱纯, 美国Fisher公司）, 乙酸铵、甲酸（色谱纯, 美国sigma-aldrich公司）。乙酸乙酯、三氯甲烷（色谱纯, 成都市科隆化学品有限公司）。

1.2 实验条件

1.2.1 LC-MS\MS条件

色谱柱:Agilent SB C18 Aq （2.1 mm× 50 mm , 1.8 μ m）; 流动相:A相, 0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸胺水溶液; B相, 甲醇。柱温:35 ℃; 流速:0.2 mL/min; 进样量:1 μ L; 梯度洗脱条件:B相初始浓度为20%, 在1 ~5 min内流动相B由20%增加到95%并保持5 min, 检测用时11 min。

离子源:电喷雾离子源（ESI）, 正离子扫描; 干燥气温度:325 ℃; 干燥气流速:10 mL/min; 雾化器压力:45 psi; 屏蔽气:氮气, 气体温度300 ℃, 流量12 mL/min; 毛细管电压:3 500 V。检测方式:多反应监测（MRM）扫描。

1.2.2 快速溶剂萃取（ASE）条件

萃取柱温度:80℃; 压力:1.034× 104 kPa; 静态萃取时间:5 min; 冲洗溶剂（乙酸乙酯:氨水溶液=97:3, 体积比）的总量为60%（萃取池体积的60%）, 每个样品之间自动冲洗2次, 氮气吹扫60 s, 静态萃取2次。

1.3 样品处理

1.3.1 溶液配制

精密称取10.0 mg 氟阿普唑仑标品于10 mL容量瓶中用甲醇混匀并定容至10.0 mL, 配成1.0 mg/mL 氟阿普唑仑甲醇储备液, 低温保存。

1.3.2 检材前处理[4, 5, 6]

准确称取样品1.0 mL匀浆后放于研钵中, 并加入2.0 g硅藻土研磨, 为了达到最佳的萃取效果, 尽可能将样品研磨混匀呈颗粒状, 装入5.0 mL的萃取池中, 按1.2.2条件用快速溶剂萃取仪萃取, 将萃取液转移至10 mL离心管中, 置于30 ℃冷冻真空浓缩仪（600 r/min）浓缩至1.0 mL左右后, 加入1 mL甲醇, 涡旋振荡混匀1 min, 将液体转移至2 mL进样瓶中, 然后置于50 ℃冷冻真空浓缩仪（300 r/min）上吹干, 用200 μ L甲醇涡旋振荡溶解, 过0.22 μ m膜, 供LC-MS/MS检验。

1.3.3 质控及标准工作曲线溶液配制

取9份1.0 mL的空白血液, 1份作为空白检材, 1份加入200 μ L 0.05 ng/mL 氟阿普唑仑标准液作为质控工作液, 7份分别添加氟阿普唑仑标准液配备成0.1、0.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL样品工作液, 与1.3.2平行操作, 作为基质标准曲线工作液。

2 结果与讨论
2.1 萃取条件优化[7, 8]

2.1.1 萃取压力和温度的选择

大部分有机溶剂在大气压条件下均保持液态, ASE所使用的压力均大于大气压, 改变压力对待测物回收率影响较小, 因此采用设备默认压力1.034× 104 kPa。本实验在1.034× 104 kPa条件下, 考察了不同的萃取温度（80、100、120 ℃）对回收率的影响, 实验结果表明, 当萃取温度在80和100 ℃时, 样品回收率差别不大, 出于对设备保护的考虑, 选择80 ℃为实验萃取温度。

2.1.2 萃取溶剂的选择

氟阿普唑仑为碱性药物, 本实验萃取条件均采用溶剂加氨水的碱性体系进行, 笔者比较了不同溶剂乙腈:氨水（97:3, 体积比）、甲醇:氨水（97:3, 体积比）、三氯甲烷:氨水（97:3, 体积比）、乙酸乙酯:氨水（97:3, 体积比）对药物回收率的影响。实验表明, 乙酸乙酯:氨水（97:3, 体积比）作萃取溶剂时, 药物的回收率最高, 因此选择乙酸乙酯:氨水（97:3, 体积比）做萃取剂。

2.1.3 循环次数的选择

在萃取条件相同的情况下, 以循环次数为变量, 笔者分别考察了1、2和3次循环对药物回收率的影响, 实验结果表明, 循环2次和3次的回收效果区别不大, 为了提高实验效率和节约溶剂, 故选择了循环2次的操作。

2.2 LC-MS/MS条件优化[9, 10, 11, 12]

2.2.1 色谱柱的选择

液相色谱检测生物检材中的苯二氮卓类药物采用C18柱较多, 实验考察了Agilent SB C18 Aq、Agi-lent Eclipse Plus C18、Luna Omega 1.6 um C1三种C18
柱, 其中 Agilent SB C18 Aq (2.1 mm× 50 mm, 1.8 μ m)的峰形和重现性最好, 无拖尾现象。

2.2.2 流动相的选择

实验考察了乙腈和甲醇两种有机相体系对氟阿普唑仑色谱峰形的影响。结果表明, 两种有机溶剂对氟阿普唑仑的保留时间无明显差别, 甲醇的峰形和响应较好, 故选择甲醇作为有机相。在0.1%甲酸水流动相加入乙酸铵, 氟阿普唑仑的峰形有明显改善, 且响应值也得到了提高。实验对水相中乙酸铵浓度对药物的响应和峰形影响进行了考察, 发现乙酸铵的浓度大小对氟阿普唑仑的峰形及响应影响不大, 故选择对色谱柱损害较小的5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸水为水相体系。

2.2.3 质谱条件的优化

用1.2.1的实验条件, 将5 ng/mL 氟阿普唑仑的标准品溶液, 进行母离子全扫描, 确定氟阿普唑仑分子离子为:m/z 327.0, 再将分子离子作为母离子进入二级质谱, 产生了两个响应最高的子离子m/z 223.0、299.0（图2）, 选择两个丰度较高的特征子离子对进行测试, 然后以响应高、峰形好、干扰小的离子对作为定量离子对, 最终选择丰度最高的m/z223.0子离子作为定量离子对, 选择m/z 299.0为定性离子对, 具体参数见表1。

图2 氟阿普唑仑质谱图Fig.2 Mass-spectrogram of flualprazolam

表1 氟阿普唑仑的质谱采集参数 Table 1 Acquisition parameters of flualprazolam with mass spectrometric determination
2.3 线性范围和检出限考察

将1.3.3制作的0.1、0.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL氟阿普唑仑标准液, 每个浓度依次由低到高分别采用1.2.1仪器条件进行测定。以氟阿普唑仑浓度为横坐标（x）, 以响应峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线, 其回归方程为:y=871.99x-388.22, r=0.999 7。结果表明, 氟阿普唑仑在浓度0.1 ~100 ng/mL范围内峰面积与浓度具有良好的线性关系; 在信噪比S/N=4.1时, 氟阿普唑仑的最低检出限（LOD）为0.05 ng/mL, 在信噪比S/N=10时, 定量限为0.1 ng/mL。

2.4 回收率及精密度实验

按1.3.2进行加标回收实验, 结果显示, 1.0、5.0、20.0 ng/mL 氟阿普唑仑在血液中的回收率为75.4%~95.3%。将1.0、5.0、20.0 ng/mL的氟阿普唑仑标液在一天内不同时间5次进样, 求平均值, 计算日内精密度（RSD, n=5）为0.86%~1.83%; 在72 h内重复进样5次, 求平均值, 计算日间精密度（RSD, n=5）为1.50%~5.85%。可见, 该方法具有较好的准确度、重复性及精密度, 能满足血液中氟阿普唑仑分析的要求。

3 结论

本文建立的血液中氟阿普唑仑的快速溶剂萃取/液相色谱-三重四极杆串联质谱仪的检验方法萃取速度快、操作简单、检出限低、回收率高、重现性好, 适用于血液中氟阿普唑仑的检测。

4 案件应用

2019年, X市公安局辖区发生一宗疑似麻醉强奸案件, 笔者应用本文方法从现场查获的白色乳液、受害者血液和尿液中均检出了氟阿普唑仑成分, 其中血液中氟阿普唑仑的含量为0.22 ng/mL。

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