miRNA是一类非编码的单链RNA分子, 由内源基因编码, 长度约为22个核苷酸, 参与动植物基因转录后表达的调控。2009年, Hanson等^[22]首次评估了miRNA在不同体液斑中的表达谱, 并筛选出一组9个miRNA集合（hsa-miR-451、hsa-miR-16、hsa-miR-135b、hsa-miR-10b、hsa-miR-658、hsa-miR-205、hsa-miR-124a、hsa-miR-372、hsa-miR-412）用以区分血液、精液、唾液、阴道分泌物和月经血, 这组miRNA具有高度的特异性和灵敏度, 在总RNA含量低至50 pg的情况下仍可准确鉴别样本的体液来源。此后, 陆续有研究者发现了多个精液特异性的miRNA分子, 并且证实它们具有良好的稳定性。2010年, Zubakov等^[23]通过基因芯片技术, 检测了5类常见体液中718种miRNA的表达情况, 最终鉴定出5种精液特异性miRNA（hsa-miR-135a、hsa-miR-10a、hsa-miR-507、hsa-miR-943和hsa-miR-891a）; 同时, 该研究还对Hanson等公布的miRNA可用于精斑鉴定的潜在位点进行了验证, 结果显示, 精液特异性miRNA的实验重复性良好。2013年Wang等^[24]应用实时定量PCR芯片检测了754种已知人类miRNA在不同体液中的表达水平, 最终筛选出了hsa-miR-891a和hsa-miR-888作为精液的分子标记。2016年, Sauer等^[25]对miRNA标记进行了全面的分析, 发现与静脉血、月经血、唾液和阴道分泌物标本相比, hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-10b-5p和hsa-miR-135-5p在精液中呈现高表达, hsa-miR-891a-5p在精液中具有极高特异性表达, 故建议将其专门用于法医精斑鉴定。但值得注意的是, 该研究还指出, 含细菌较多的体液样本提取到的可注释miRNA数量相对较少, 这可能是由于内源细菌中的小RNA过饱和所致, 这提示样本中的细菌对miRNA的检测可产生影响。尽管该研究只在阴道液、唾液和粪便的检测中观察到这种现象, 但需指出, 该实验中的样本是志愿者的未混合精液, 而在实际案件中, 精斑样本往往由阴道拭子中获得, 故精斑样本中也会含有大量细菌。目前尚缺乏细菌对样本miRNA检测影响机制的研究, 细菌内源性小RNA对样本miRNA是否有影响, 以及应如何规避还有待进一步实验探究。

在miRNA的检测上, 目前还没有统一的法医学检测标准。RT-qPCR是目前检测miRNA表达最常用的方法, 在反应体系中加入荧光基团, 通过扩增指数期荧光信号的积累, 对起始模板进行定量分析。该方法能够用于低表达靶分子的检测^[26]。目前, 新一代测序技术可以在一次测序中对几百万个样本进行测序, 与上文所述DNA甲基化的芯片筛选技术一样可实现高通量检测, 极大提高了测序效率。例如, 较为常用的Solexa基因组测序^[27], 可消除miRNA序列短、同属一个家族的miRNA高度相似性的问题, 易于发现序列的微小差异并设计探针, 而且还能对未知序列进行分析。目前针对miRNA的检测方法存在一定局限性, 例如RT-qPCR难以精确测定miRNA表达水平, 基于测序原理的芯片尽管能够快速且高灵敏度地检测miRNA, 但成本较高难以普及使用。因此, 开发高通量、高灵敏度且能在法医学鉴定中广泛应用的miRNA检测方法具有实践意义。

在miRNA受到法医物证学广泛关注的同时, 有学者提出了其特异性表达实验重复性差的问题。2015年, Silva等^[28]通过总结与比较各主要实验室的研究结果, 发现包括精液在内的多种体液特异性miRNA均存在可重复性差的情况。目前不同实验室即使应用相同的技术进行miRNA的筛选及验证, 结果也不尽相同, 这可能是由于miRNA的表达水平易受疾病、年龄、人种、温度等多种因素干扰。另外, 与以前通过mRNA鉴定体液斑^[29]的研究类似, miRNA定量结果会受到细菌RNA的影响, 如何排除细菌对检测的影响, 还需进一步研究。目前mRNA与DNA共提取技术已有很好的突破, 希望研究者也能进一步优化miRNA/DNA共提取技术。此外, miRNA的物种特异性不如mRNA, 2019年Peng等^[30]发现部分人类体液中的miRNA在猫、狗、小鼠、兔的体液中也有表达, miRNA的物种间保守性不利于其作为法医精斑鉴定的标记, 因此, 基于miRNA的检材体液进行来源鉴定之前, 应先进行种属鉴定。

环状RNA（circRNA）是一类新型的非编码RNA, 是RNA经过反向剪接形成的单链共价闭合环状分子, 其无5′ 末端帽子及3′ 末端poly(A)尾巴结构^[31]。迄今为止, 研究人员已发现circRNA在各种组织和体液中含量丰富^[31]。2018年, 赵禾苗等^[32]制备了精液、唾液和阴道分泌物的体液斑样品, 用QIAGEN RNeasy Micro试剂盒提取总RNA, 经RNase R消化获得circRNA, 通过逆转录PCR扩增, 结合琼脂糖凝胶电泳进行分析, 证明在制备的体液斑样品中可以检测到circRNA分子, 这证实circRNA存在于法医学实践的常见体液（斑）中。2017年, Song等^[33]使用Arraystar人类circRNA芯片（Human Circular RNA Array）以5 396种已知人类circRNA的捕获探针, 探究精液、静脉血、经血、唾液和阴道分泌物circRNA的表达水平与差异。结果证明circ-RNA在精液中呈现特异性表达, 可以通过circRNA微阵列表达谱将精液与其他体液进行区分。2020年Liu等^[34]对精液中的TGM4、KLK3和PRM2进行qPCR分析, 认为其在精液中的特异性表达有助于精斑鉴定。

环状RNA的检测和量化面临着许多重大挑战, 包括错误率高、rRNA清除程度不一、RNA酶处理效率不一、反剪切接合位点测序读段评估性不足等。2020年, Zhang等^[35]提出新的程序CIRIquant, 用于精确的circRNA定量和差异表达分析。该程序在肝癌细胞中成功发现了两类circRNA的成环比例及成环位点的显著改变, 证明该程序在肝脏肿瘤转录组研究中有着良好的潜力, 其能否应用于法医精斑鉴定还需进一步验证。除检测和量化方法的提高外, 数据库的建立也为相关研究提供了便利。2017年, Xia等^[36]对302 853个组织特异性circRNA进行分析, 构建了组织特异性的circRNA数据库（http://gb.whu.edu.cn/TSCD）, 对circRNA的组织特异性进行了全面的描述性存贮。目前针对circRNA已建立的几个数据库如circ2Traits（http://gyanxet-beta.com/circdb）、circ-RNABase （http://starbase.sysu.edu./cn/mirCircRNA.php）、deepBase （http://deepbase.sysu.edu.cn）、CircNet （http://circnet.mbc.nctu.edu.tw）、circBase （http://www.circbase.org）等正日趋完备, 但专门用于法医学实践的体液鉴定数据集（组）合尚未见开发。

piRNA由哺乳动物生殖细胞中分离而来, 长度约为30 nt。piRNA可与PIWI蛋白家族成员结合而发挥其调节作用。文献表明, piRNA通过Piwi-piRNA复合物介导基因沉默, 在生殖细胞生长发育中起调控作用^[37]。但对piRNA的研究目前还处于起步阶段, 因此其功能及特性仍在研究中。为寻找和开发适用于体液来源鉴别的piRNA生物标志, 2019年Wang等^[38]应用TaqMan定量实时聚合酶链反应对唾液、静脉血、月经血、精液和阴道分泌物四种体液进行piRNA表达水平检测。实验证明, piR-55521在精液中呈现特异性表达, 其在精液中的表达强度是其余三种体液的4 000倍以上, 且piR-55521可在精液总RNA含量低至200 pg的样本中仍能检出, 在样本中添加女性体液成分对检测也无影响。其稳定性良好, 可在放置六个月的样本中检出。该实验证明piRNA具备作为生物标记进行检材体液来源鉴定的潜力。

通过以上对miRNA、circRNA、piRNA在精斑鉴定方面研究成果的梳理可知, 目前miRNA、circRNA的研究较多, 完备数据库的构建也为相关研究提供了便利。从特异性看, 三种非编码RNA皆具备良好的组织特异性, 且已发现许多精斑特异性的检测位点。然而, miRNA的物种间特异性以及实验重复性也受到质疑, 目前很少有文献对circRNA和piRNA提出类似质疑, 希望未来有更多的实验可提供关于它们应用可行性的证据。从稳定性上看, circRNA稳定性比miRNA高, 因此对于陈旧或降解检材的检测更具优势; 同时, circRNA具有抗RNA酶降解的能力, 在提取RNA过程中适度添加RNase R可减少线性RNA在检测过程中的干扰。从与现有STR基因分型平台的兼容情况看, miRNA一般只能通过实时定量PCR检测; 而circRNA的序列较长, 可以通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳检测, 检测手段可与现有的法医检测技术平台良好兼容^[32]。因此circRNA有着更好的法医学应用前景。piRNA由于发现晚, 相关数据库尚未建立, 法医学应用研究很少, 其稳定性、灵敏度以及能否与现有的STR基因分型技术相兼容等问题, 尚待实验探究。