仪器：离子溅射仪（EM ACE200, 德国徕卡公司）、多联真空抽滤仪（HL-6, 珠海黑马医学仪器有限公司）、扫描电镜（FEI Quanta650, 美国FEI公司）、能谱仪（EDS, 英国牛津仪器集团）、有机膜抽滤杯（Y-220, 珠海黑马医学仪器有限公司）。

试剂：无水乙醇（分析纯, 天津恒兴）、浓硝酸（分析纯, 昆山金城试剂有限公司）、甲醛（莱阳市康德化工有限公司）。

1.2.1 水样采集

时间地点：2018年7月份和2019年4月份对德州11个区县主要水域, 包含102条河流、21个湖泊和7个水库共130个取水地点进行两次采样。

采样方法：距离岸边0.5~1.5 m, 水面下10 cm取500 mL水样, 加1 mL甲醛水溶液后常温保存。盛装水样的容器避免重复使用, 取样前用取样水域水样冲洗3次, 取样后用纯净水冲洗3次。

1.2.2 样品处理及分析

采用强酸消解-真空抽滤-扫描电镜法检测水样中的硅藻^{[2, 3]}, 具体步骤如下：

强酸消解：取50 mL水样, 置于烧杯内, 加入10 mL浓硝酸, 90 ℃加热30 min。

真空抽滤：消解水样与超纯水以1:5比例混合, 采用多联真空抽滤仪进行抽滤, 完成后加50 mL超纯水抽滤使滤膜表面接近中性, 然后加10 mL乙醇抽滤, 烘干后置于样品台上, 利用离子溅射仪镀金膜。

电镜检测：利用牛津能谱仪的GSR软件, 在滤膜有效抽滤范围内以圆形区域自动采集图片, 通过硅藻细胞壁的花纹分辨硅藻种属^{[4, 5]}。扫描电镜和能谱仪工作参数：加速电压为20 kV, 工作距离10 mm, 束斑大小4.5 nm, 放大倍数800倍。在利用GSR软件采集完图片后, 分别以10个不同视场作为起始视场, 采取等距法挑选出10组（每组20个视场）, 对10组视场分别进行硅藻含量和种属分类统计^[6-^9]。

数据库建立：统计各水样中硅藻的含量及种属组成; 计算各种属的相对丰度和优势种属优势率; 拍摄硅藻种属细目照片。根据种属分类制作硅藻扫描电镜图谱库, 按照采样点地域位置建立硅藻分布概况数据库^[10]。

统计分析：四分位数分析, 进行配对秩和检验, 分析研究因季节不同、水域不同造成的硅藻种属和数量差异特征^{[11, 12, 13]} 。

本次研究部分采样点检验数据如表1。其中马颊河流域春夏差异最大, 平原马颊河和幸福大道马颊河两个采样点夏季比春季增幅为7 918.27 %和5 676.00 %。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 硅藻检验数据 Table 1 Data of diatom tested from various waters and seasons (spring and summer) 采样点 春季/（个/10 mL） 夏季/（个/10 mL） 夏季比春季增幅/% 采样点 春季/（个/10 mL） 夏季/（个/10 mL） 夏季比春季增幅/% 平原张茂吴沟 1333 11703 777.94 南贾村西河道 2355 11566 391.13 跃马河 13647 2649 -80.59 明月湖 10954 5653 -48.39 跃丰河张桥段 390 2569 558.72 庙留庄村东侧河 561 1203 114.44 禹城徒骇河 13733 21692 57.96 孟王庄村河 10446 12907 23.56 严务水库 2767 2992 8.13 平原马颊河 104 8339 7918.27 新湖 12829 15991 24.65 叶堤口马颊河 24845 41588 67.39 仙人湖 东南角 363 5438 1398.07 幸福大道马颊河 896 51753 5676.00 朱庄村西河 15403 14001 -9.10 禹城新湖 4390 3628 -17.36 卧虎庄北侧河 830 1892 127.95 旅游路跃马河 531 5147 869.30 滕庄村北侧河 11766 7041 -40.16 临邑明德湖 190083 22723 -88.05 德百温泉西湖 526 7707 1365.21 三十里铺中桥 2152 6491 201.63 官庄段六五河 13639 10688 -21.64 仙人湖 3595 1479 -58.86 德百温泉北河 1297 21944 1591.90 看守所南水沟 4997 5090 1.86 城区倪伦河 9399 13084 39.21 九龙口湿地公园 6695 10761 60.73 城区大清河 16203 19273 18.95 京杭大运河 6269 51967 728.95 碧桂园东侧水湾 6935 66024 852.04 津期店村西河 155 362 133.55 庆乐交界南干 11293 189860 1581.22 解集囤水湾 4610 13784 199.00 双庙南段青年河 2389 7546 215.86 减河东风桥 4158 13374 221.65 平原琵琶湖 21813 20060 -8.04 护城河 11128 14276 28.29 后庙村东河道 57074 74139 29.90 户王庄村西河 5539 20787 275.28

表1 硅藻检验数据 Table 1 Data of diatom tested from various waters and seasons (spring and summer)

2.1.1 春夏两季水中硅藻的含量对比

对两季硅藻含量进行四分位数检验和配对秩和检验, 可以得出夏季的硅藻含量高于春季的硅藻含量（表2）。河流两个季节硅藻含量无统计学差异（P> 0.05）, 湖泊的两个季节硅藻含量存在统计学差异（P< 0.05）, 水库的两个季节硅藻含量存在统计学差异（P< 0.05）。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 硅藻含量四分位数检验 Table 2 Quartile test of diatom contents 样品数 25百分位 50百分位 75百分位 夏季整体 130 2598 8340 21755 春季整体 130 2231 6482 16053 夏季河流 102 2644 7242 21086 春季河流 102 2473 8034 19652 夏季湖泊 21 3161 8807 23171 春季湖泊 21 1580 6118 12032 夏季水库 7 934 9900 39316 春季水库 7 53 308 2767

表2 硅藻含量四分位数检验 Table 2 Quartile test of diatom contents

2.1.2 不同时间及水域中硅藻含量差异

在春季采样时, 禹城大禹公园采样点的硅藻含量最多, 含量达608 020个/10 mL; 李家岸引黄干渠309处采样点的硅藻含量最少, 含量为10个/10 mL; 各个水域的硅藻平均含量为22 401个/10 mL; 硅藻含量在10 000个/10 mL以上的水域占全部水域的44.6 %。在夏季采样时, 庆乐交界南干采样点的硅藻含量最多, 含量达189 860个/10 mL; 京杭大运河郑保店屯段采样点的硅藻含量最少, 含量为222个/10 mL; 各个水域的硅藻平均含量为18 280个/10 mL; 硅藻含量在10 000个/10 mL以上的水域占全部水域的37.7%。

2.1.3 不区分季节统计和春季统计情况下硅藻的含量对比

根据表2, 不区分季节和春季情况下, 水样中硅藻浓度：河流> 湖泊> 水库, 存在统计学差异（P< 0.05）; 在夏季水样数据中无明显规律。

2.1.4 同一河流在不同流域硅藻含量不同

同一河流在不同流域由于各种环境因素的不同硅藻含量不同, 如德惠新河, 夏季在平原王付廷段硅藻含量为3 838个/10 mL, 在平原王凤楼段为153 015个/10 mL, 在陵城区段为51 858个/10 mL。

从德州市主要水域的130个采样点中共检出28个种属的硅藻, 分别属于中心纲和羽纹纲硅藻。本文选取了小环藻属、菱形藻属、舟形藻属、针杆藻属、等片藻属、双菱藻属、波缘藻属、棒杆藻属等8个种属的电子显微镜图片（图1）。前4个硅藻种属为本地区检出率最高的4个种属, 后4个硅藻种属为检出率较低具有特征性的4个种属。

图1

Fig.1

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	图1 硅藻的电子显微镜图片（a~h分别为小环藻属、菱形藻属、舟形藻属、针杆藻属、等片藻属、双菱藻属、波缘藻属、棒杆藻属）Fig.1 Scanning electron-microscopic images of diatoms (a~h stands for the respective Cyclotella, Nitzschia, Navicula, Synedra, Diatoma, Surirella, Cymatopleura and Rhopalodia)

2.2.1 各县市区硅藻种属数量

十一个县市区的硅藻种属数量平均为23种, 各地区硅藻种属数量差距不大, 武城县种属最多（26种）, 宁津县种属最少（20种）。

2.2.2 水域中硅藻的优势种属的统计

对采集的水样中硅藻种属进行分类统计, 用物种优势度指数（优势率, Y）进行分析。以禹城市6个采样点为代表, 进行统计说明（表3）。

物种优势度指数Y=（n_i/N）× f_i

公式中N为采样点的硅藻总数, n_i为第i种属的硅藻数量, f_i表示在采样点i种属硅藻出现的频率, 当Y> 0.02时, 该硅藻种属为优势硅藻种属。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 禹城硅藻优势种属表 Table 3 Dominant species of diatom in the area of Yucheng 采样点 优势种属（优势率） 大禹公园夏季 小环藻属(0.9857) 大禹公园春季 菱形藻属(0.9983) 禹城新湖夏季 小环藻属(0.8211)、菱形藻属(0.0557)、舟形藻属(0.0719)、脆杆藻属(0.0232) 禹城新湖春季 小环藻属(0.8513)、菱形藻属(0.0711)、针杆藻属(0.0558)、 徒骇河夏季 小环藻属(0.6335)、菱形藻属(0.1166)、舟形藻属(0.0751)、针杆藻属(0.0583)、海链藻属(0.0414) 徒骇河春季 小环藻属(0.7366)、菱形藻属(0.0512)、针杆藻属(0.1780) 丰产河夏季 小环藻属(0.3957)、菱形藻属(0.4770)、舟形藻属(0.0514)、针杆藻属(0.046) 丰产河春季 小环藻属(0.4396)、菱形藻属(0.4535)、舟形藻属(0.0617)、针杆藻属(0.0265) 赵牛河夏季 小环藻属(0.5391)、菱形藻属(0.2922)、舟形藻属(0.0604)、针杆藻属(0.0453)、尾管藻属(0.0222) 赵牛河春季 小环藻属(0.0980) 、针杆藻属(0.8893) 幸福河夏季 小环藻属(0.9384) 幸福河春季 小环藻属(0.3113)、针杆藻属(0.6522)

表3 禹城硅藻优势种属表 Table 3 Dominant species of diatom in the area of Yucheng

2.2.3 同一水域两个季节的优势种属和优势率

同一水域两个季节的优势种属有的相同, 有的不同; 同一水域两个季节的优势种属的优势率都不同。以禹城各个采样点为例, 丰产河的两个季节的硅藻优势种属相同, 禹城其他水域的两个季节的硅藻优势种属都不同, 每个采样点两个季节的优势种属的优势率都有区别。

2.2.4 不同水域中硅藻的种属特点

不同水域硅藻的种属构成均有不同, 优势种属也有差别。如禹城6个采样点检出硅藻种属的个数, 大禹公园5个, 禹城新湖7个, 禹城徒骇河22个, 丰产河7个, 赵牛河12个, 幸福河16个。有的水样中优势种属只有一种, 如春季大禹公园只有小环藻一种优势种属, 优势率为0.998 3; 有的水样中有多种优势种属, 如春季禹城新湖, 小环藻属优势率为0.851 3、菱形藻属优势率为0.071 1、针杆藻属优势率为0.055 8。

2.2.5 同一种属硅藻在不同水域中丰富度特点

由于不同的水域水环境不同, 同一种硅藻在不同水域中的丰富度不同。如桥弯藻属在丁东水库相对丰度为6.69%, 在新湖相对丰度为0.21%, 在跃马河中未检出。图2为11处夏季采样点桥弯藻属的相对丰度。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 桥弯藻属在不同水域的相对丰度Fig.2 Relative abundance of the diatom of Cymbella in different waters

2.2.6 不同的水域中硅藻种属分布特点

所有检出的硅藻中, 小环藻属、菱形藻属、舟形藻属、针杆藻属、桥弯藻属、海链藻属为最常见的硅藻, 在大部分水域中可以检出。平板藻属、美壁藻属、短缝藻属、棒杆藻属、波缘藻属在水样中的检出率低, 可作为检出该硅藻水域的特征硅藻。以上硅藻种属的检出率见图3。

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 硅藻种属的检出率Fig.3 Percentage of diatom species having been identified

3.1.1 采样点的选择

在选择采样点时, 首先调研本地水域概况和水中尸体案事件多发水域。采样点要覆盖本地区主要的河流、湖泊、水库和溺水高发水域。在跨县市区的大河选择采样点时, 在流经的县市区都要设置采样点。充足的样本量是建立数据库的基础。

3.1.2 水样的抽滤

在水样消解后, 要严格按要求加入5倍体积的超纯水, 混合均匀后抽滤。此步骤的目的是稀释水样中强酸的浓度, 抽滤时保护滤膜不被腐蚀。实验操作中, 可能会为了缩短抽滤时间减少加入超纯水量, 结果往往会适得其反。如果滤膜被腐蚀, 水样要重新处理, 既浪费时间又增加耗材成本。

3.1.3 硅藻含量和种属的统计

在本研究中, 选择了10组（每组20个视场）视场的数据来计算10 mL水样中硅藻的含量和种属丰富度。用ANOVA方法比较10组数据的差异, 无统计学意义^[7]。硅藻抽滤后在滤膜上分布相对均匀, 此方法计算硅藻的含量和丰富度结果可靠。选择视场统计时至少要选择10组视场, 视场选择较少时容易遗漏含量较低的硅藻种属。

在水中尸体案件中, 一般只对尸体脏器中检出的硅藻和尸体处的水样中硅藻进行比对。检验的结果也只能是脏器中的硅藻与取样时水样中的硅藻是否一致。硅藻库建立后, 脏器硅藻检验结果可以与库中该河流硅藻数据进行比对。与该河流不同流域硅藻数据进行比对, 不同流域硅藻含量和种属不同, 可以帮助判断死者的落水位置; 与该河流不同季节的硅藻数据进行比对, 不同季节硅藻的含量和种属存在差异, 对水中尸体的死亡时间判断有一定的参考价值。

硅藻是喜好低温的生物, 水量丰富、温度相对较低的环境条件有利于硅藻在生存竞争中占优势。氮、磷、硅等营养盐供给对水中硅藻的浓度有很大的影响。当氮、磷、硅等营养盐供给充分时, 水中硅藻数量增多, 严重时会发生水华现象。当水体的流量、流速、pH值、含沙量、离子浓度、咸淡程度等理化条件变化时, 水中硅藻的种属和数量会发生相应的变化^[14]。

综上, 本研究为德州地区办案人员判断水中尸体的落水地点和死亡季节提供了重要依据, 同时也为其他地区建立硅藻数据库提供了参考。