引用本文
徐曼曼, 杨发震, 李虹, 张文竞, 苏少明, 段正萍. UPLC-MS/MS法同时检测全血中16种除草剂[J].刑事技术, 2021,46(2):127-133
XU Manman, YANG Fazhen, LI Hong, ZHANG Wenjing, SU Shaoming, DUAN Zhengping. Simultaneous UPLC-MS/MS Determination of 16 Herbicides in Whole Blood[J]. Forensic Science and Technology,2021,46(2): 127-133  
Doi: 10.16467/j.1008-3650.2021.0036
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《刑事技术》编辑部
UPLC-MS/MS法同时检测全血中16种除草剂
徐曼曼1, 杨发震2, 李虹3, 张文竞1, 苏少明2, 段正萍1
1.昆明医科大学法医学院,昆明 650500
2.玉溪市公安局刑事科学技术研究所,云南 玉溪 653100
3.毒品分析及禁毒技术公安部重点实验室,昆明 650228

第一作者简介：徐曼曼,女,山东济宁人,硕士研究生,研究方向为法医毒物分析。E-mail: 229308223@qq.com

摘要

目的 建立全血中16种除草剂的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）同时检测方法,为除草剂中毒案事件及其他刑事案件血液中该16种除草剂的检验鉴定提供依据。方法 取200μL的血液,加入800μL乙腈-水（体积比80/20）,进行蛋白沉淀后,采用Acquity BEH C18（2.1mm×100mm,1.7μm）色谱柱,以水（5mmol/L的甲酸铵,0.1%的甲酸）-乙腈为流动相进行梯度洗脱,采用电喷雾离子源（ESI）、多反应监测（MRM）正离子模式对16种化合物进行检测。结果 在1~200ng/mL范围内线性关系良好, R2均大于0.996;基质效应（ME%）为85.2%~104.4%,相对标准偏差（RSD%）为0.72%~4.84%;仪器检出限（IDLs）为0.2~2ng/mL（信噪比S/N≥3）,方法检出限（MDLs）为0.5~3ng/mL(信噪比S/N≥3）,最低定量限（LOQs）为1~7ng/mL（信噪比S/N≥10 ）。结论 本实验建立的全血中16种除草剂同时检验方法,前处理简便快捷、回收率高、精密度好、方法检出限低,可作为该16种除草剂中（投）毒案件的检验方法。

关键词: 法医毒物分析; 除草剂; 全血; 超高效液相色谱-串联质谱
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2021)02-0127-07
Simultaneous UPLC-MS/MS Determination of 16 Herbicides in Whole Blood
XU Manman1, YANG Fazhen2, LI Hong3, ZHANG Wenjing1, SU Shaoming2, DUAN Zhengping1
1. Institute of Forensic Medicine, Kunming Medical University, Kunming 650500, China
2. Institute of Criminal Science and Technology, Yuxi Public Security Bureau, Yuxi 653100, Yunnan, China
3. Ministry of Public Security’s Key Laboratory of Narcotics Assay and Control Technology, Kunming 650228, China
Abstract

Objective To establish a method for simultaneous determination of 16 herbicides in whole blood through UPLC-MS/MS so as to provide reference for identification of the herbicidal poisoning and relevant cases.Methods 200 μL sampling blood, spiked of 16 selected herbicides, was added with 800 μL solution of acetonitrile-water (80/20, V/V) to have the protein precipitated. Through the Acquity UPLC BEH C18 (100×2.1mm, 1.8μm) column being flowed with 0.1% formic acid water (5mmol/L ammonium formate) - acetonitrile as the mobile phase, the treated blood was undergone into the UPLC-MS/MS detection that was carried out under the electrospray positive ionization (ESI+) and MRM mode, having the 16 selected herbicides analyzed.Results The 16 herbicides showed good linear relationship in the range of 1-200 ng/mL, with the coefficients of determination being R2>0.996, matrix effects (ME%) 85.2%-104.4%, and the relative standard deviations (RSD%) 0.72%-4.84%. The method revealed its instrument detection limits (IDLs) 0.2-2ng/mL (S/N≥3), detection limits (MDLs) 0.5-3ng/mL (S/N≥3), and limits of quantification (LOQs) 1-7ng/mL (S/N≥10).Conclusions Such one simultaneous method established here for determination of 16 herbicides in whole blood is simple and efficient, demonstrating high recovery, high precision and low detection limit, capable of determination of the 16 herbicides and similar poisoning cases.

Key words: forensic toxicological analysis; herbicide; whole blood; UPLC-MS/MS

除草剂又称除莠剂, 指使杂草彻底或者有选择地发生枯死的药剂, 可有效防除一年生禾本科杂草、阔叶杂草, 某些多年生恶性杂草及清除池塘中的水草和有害藻类[1], 对促进农业发展和提高粮食作物产量发挥重要作用。然而, 随着近些年除草剂的大量使用, 农药残留对于生态环境、食品安全以及人类健康的影响引起国内外广泛关注。目前, 对于除草剂的检测方法主要有气相色谱法（GC）[2, 3, 4]、气相色谱-串联质谱法(GC-MS)[5, 6, 7, 8]、高效液相色谱法（HPLC）[9, 10]、超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)[11, 12, 13, 14]、毛细管电泳技术[15, 16]等, 检测多集中在农产品如大米、玉米、大豆、蔬菜[2, 3, 4, 11, 17], 水产品如鲤鱼、虾[13], 以及烟草[9], 土壤[6], 水[10, 12]等基质中除草剂的残留情况。在人类生物样品中除草剂的检测方面, 有Ariffin 等[18]利用LC/MS/MS法对全血基质中敌草快、百草枯、燕麦枯三种除草剂进行同时检验, 王国强等[7]使用固相萃取-硅烷化-气质联用检验尿液中的莠去津, 而通过LC-MS/MS法同时检测血液中多种除草剂的检验方法, 目前报道不多。

本实验建立的全血中16种除草剂的UPLC-MS/MS同时检测方法, 其前处理操作简便快捷, 样品量消耗少, 可作为司法案件全血中该16种除草剂的检测方法及依据。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

Waters Acquity超高效液相色谱和Waters Xevo® TQ-S Micro三重四级杆串联质谱仪（美国Waters公司）, PURELAB Flex纯水系统（英国ELGA公司）, XW-80A涡旋混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司), H/T18MM台式高速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）, KQ-250DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）, 分析天平（METTLER TOLEDO）, 0.22 μ m微孔滤膜（天津市津腾设备有限公司）。

禾草丹、特丁净、莠灭净、丙草胺、异丙甲草胺甲醇标准物质溶液, 乙草胺、阿特拉津、灭草隆、敌草隆丙酮标准物质溶液, 氰草津乙腈标准物质溶液（纯度：100 μ g/mL, 均购自农业部环境保护科研检测所）; 西草净标准品（纯度：99.20%, 购自北京北纳创联生物技术研究院）; 扑草净甲醇标准物质溶液（纯度99.90%, 购自美国Bellefonte.PA公司）; 敌草净乙腈标准物质溶液（纯度100 ng/μ L, 购自德国Augsburg公司）; 杀草净、枯莠隆、除草定标准品（纯度分别为：98.5%、99.0%、99.0%, 均购自德国Augsburg公司）; 甲醇和乙腈（HPLC级, 购自美国Fisher公司）; 甲酸铵（高纯, 购自天津市光复精密化工研究所）; 甲酸（色谱纯, 购自天津市光复精密化工研究所）。

新鲜血液由玉溪市供血站提供。

1.2 实验方法

1.2.1 混合标准溶液的配制

分别称取杀草净、枯莠隆、除草定、西草净标准品10.15、10.10、10.10、10.08 mg置于棕色样品瓶中, 溶解于10 mL甲醇中, 得到浓度为1 mg/mL的单标储备液; 将16种除草剂单标储备液分别稀释并配制成1 μ g/mL、100 ng/mL的混合标准储备液, 冷冻保存。

1.2.2 样品前处理

取200 μ L血液, 加入800 μ L乙腈-水（80/20）于15 mL塑料离心管中, 涡旋混匀30 s, 超声10 min, 离心（5 min, 12 000 r/min）, 取上清液, 过0.22 μ m膜后, 供UPLC-MS/MS分析。

1.2.3 仪器条件

色谱柱：Waters Acquity UPLC® BEH C18 柱（2.1 mm× 100 mm, 1.7 μ m）, 柱温：35 ℃, 样品室温：5 ℃。

流动相条件及梯度：A相为0.1%甲酸（5 mmol/L甲酸铵）水溶液, B相为乙腈, 流速为0.40 mL/min。梯度洗脱程序见表1。进样量为5 μ L。

表1 流动相梯度洗脱条件 Table 1 Gradient elution conditions of mobile phase

质谱条件：电喷雾离子源正离子（ESI+）及多反应监测模式, 毛细管电压：3.5 kV, 离子源温度：150℃, 脱溶剂气温度：600℃, 脱溶剂气流速：1 000 L/h, 锥孔气流速：150 L/h, 碰撞气：氩气, 流速：0.14 mL/min。

系统操作采用数据处理软件MassLynxTM V4.1 SCN 919及TargetLynx V4.1 SCN 919软件 (Waters)。16种除草剂的保留时间、离子对、锥孔电压、碰撞能见表2。

表2 16种除草剂的检测参数 Table 2 MRM transitions, cone voltages, collision energies (Coll) and retention times (RT) of 16 herbicides
2 结果与讨论
2.1 前处理条件选择

本实验分别考察不同比例的乙腈水与甲醇水直接沉淀蛋白的前处理方法, 乙腈组的比例为40%乙腈水、60%乙腈水、80%乙腈水、100%乙腈; 甲醇组的比例为40%甲醇水、60%甲醇水、80%甲醇水、100%甲醇。

在空白血中添加混合标准溶液, 配制成20、80、150 ng/mL的加标样品, 分别取200 μ L不同浓度的加标样品, 加入800 μ L的上述不同比例的乙腈和甲醇, 按照1.2.2节进行处理, 平行3次进样。

结果表明相同比例的乙腈组和甲醇组, 乙腈的提取效果更好, 回收率更高; 乙腈组中100%乙腈在20 ng/mL时提取效果比80%乙腈稍好; 在80、150 ng/mL时, 80%乙腈提取效果更佳, 乙腈比例越低提取效果越差。

实验中发现使用100%乙腈作为提取溶剂进行样品处理时样品不能完全分散, 最终选择80%乙腈作为前处理提取溶剂, 其回收率74%~127%, 相对标准偏差（RSD）在1.1%~4.3%之间。16种除草剂分别在乙腈与甲醇（80%、100%）中的回收率见表3。

表3 16种除草剂在乙腈与甲醇中的回收率对比 (n=3) Table 3 Comparison of recoveries of 16 herbicides extracted with acetonitrile and/or methanol (n=3)
2.2 液相条件选择

为了能使色谱分离和色谱峰形达最佳效果, 本实验考察了甲醇-水, 乙腈-水, 0.1%甲酸（5 mmol/L甲酸铵）水-乙腈, 水（0.025%乙酸, 10 mmol/L乙酸铵）- 甲醇(0.025%乙酸, 10 mmol/L乙酸铵)为流动相的分离情况, 发现用0.1%甲酸（5 mmol/L甲酸铵）水-乙晴的流动相能较好改善大部分除草剂的分离效果和峰形, 因此选择此流动相为液相条件。因部分三嗪类除草剂性质和结构相近, 采用上述条件不能完全分离, 但由于质谱的离子扫描模式（MRM）, 避免待测物之间的相互干扰, 因此并不影响准确定量和定性分析。16种除草剂的总TIC色谱图见图1。

图1 16种除草剂的TIC色谱图
1.西草净、敌草净（2.84min）; 2.除草定（2.94min）; 3.灭草隆（2.99min）; 4.氰草津（3.04min）; 5.莠灭净（3.26min）; 6.阿特拉津（3.43min）; 7.敌草隆（3.46min）; 8.枯莠隆（3.48min）; 9.扑草净（3.68min）; 10.特丁净（3.72min）; 11.杀草净（4.06min）; 12.异丙甲草胺（4.31min）; 13.乙草胺（4.33min）; 14.禾草丹（4.72min）; 15.丙草胺（4.87min）Fig.1 TIC chromatograms of 16 standard reference substances

2.3 方法的线性方程、基质效应、检测限、定量限

分别配制1、2、5、10、20、50、80、100、150、200 ng/mL空白基质加标溶液, 获得16种除草剂的工作曲线。结果表明16种除草剂在1~200 ng/mL范围内呈良好的线性关系, R2均大于0.996, 满足定量分析的要求。16种除草剂回归方程、R2见表4。取空白新鲜血液按照1.2.2节进行处理, 获得空白基质提取液, 配制低、中、高（20、80、150 ng/mL）三个水平的基质加标样品, 三次平行测定, 基质效应（ME）为85.2%~104.4%, 相对标准偏差（RSD）为0.72%~4.84%, 表明基质对化合物无影响; 取空白基质提取液进行标样添加, 进行仪器检出限（IDLs）测定, 取空白血进行标样添加前处理, 进行方法检出限和最低定量限测定; 结果仪器检出限为0.2~2 ng/mL（信噪比S/N≥ 3）, 方法检出限为0.5~3 ng/mL（信噪比S/N≥ 3）, 最低定量限为1~7 ng/mL（信噪比S/N≥ 10）。16种除草剂基质效应、检出限、定量限见表4。16种除草剂的MRM色谱图见图2。

表4 16种除草剂的回归方程、R2、基质效应、仪器检出限（IDLs）、方法检出限（MDLs）、定量限（LOQs） Table 4 Regression equation, R2, matrix effect (ME%, n=3), instrument detection limits (IDLs), method detection limits (MDLs) and limits of quantification (LOQs) of 16 herbicides

图2 16种除草剂的MRM色谱图Fig.2 MRM chromatograms of 16 standard reference substances

2.4 方法的日内、日间精密度

取空白基质提取液, 配制低、中、高（20、80、150 ng/mL）三个水平的基质加标样品, 平行6次进样, 连续三天, 进行日内、日间稳定性及精密度测试。第二天浓度分别为17.9~26.4 ng/mL、76.7~91.8 ng/mL、144.4~157.3 ng/mL, 相对标准偏差（RSD）为0.9%~3.2%、0.9%~3.4%、0.3%~3.8%; 第三天为18.6~22.1 ng/mL、73.9~89.2 ng/mL、142.4~159ng/mL, 相对标准偏差（RSD）为0.9%~7.5%、1.5%~3.7%、0.8%~2.3%; 结果表明目标化合物在全血基质中稳定性良好。结果见表5。

表5 16种除草剂在全血中的日内、日间精密度(n=6) Table 5 Intra- and inter-day precisions of 16 herbicides (n=6)
3 结论

本实验建立了能对全血中16种除草剂同时快速分析的超高效液相色谱-串联质谱分析方法, 采用乙腈-水（体积比80/20）直接沉淀蛋白的样品优化前处理技术, 方法简便快捷、回收率高、精密度好、方法检出限低, 可作为该16种除草剂中（投）毒案件的检验方法。

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