引用本文
肖成, 朱晓琳, 徐曲毅, 韩雅莉, 李越, 余仲昊, 李欢, 彭帆, 刘向东, 刘超. 气单胞菌 aerA和 hlyA两基因在溺死诊断中的应用 [J].刑事技术, 2021,46(2):111-118
XIAO Cheng, ZHU Xiaolin, XU Quyi, HAN Yali, LI Yue, YU Zhonghao, LI Huan, PENG Fan, LIU Xiangdong, LIU Chao. Applicability of Aeromonas Genes of aerA and hlyA into Diagnosis of Drowning [J]. Forensic Science and Technology,2021,46(2): 111-118  
Doi: 10.16467/j.1008-3650.2020.0003
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《刑事技术》编辑部
气单胞菌 aerA和 hlyA两基因在溺死诊断中的应用
肖成1,2, 朱晓琳3, 徐曲毅1,3, 韩雅莉3, 李越1, 余仲昊1,2, 李欢1,4, 彭帆3, 刘向东3, 刘超1,2,*
1.广州市刑事科学技术研究所,公安部法医病理学重点实验室,广州 510442
2.南方医科大学法医学院,广州 510515
3.广东工业大学轻工化工学院,广州 510006
4.重庆医科大学基础医学院,重庆 400016
* 通信作者简介：刘超,男,湖北十堰人,博士,教授,研究方向为法医物证学。E-mail: liuchaogzf@163.com

第一作者简介：肖成,男,湖南耒阳人,硕士研究生,研究方向为法医物证学。E-mail: 1243164810@qq.com

基金资助: 广州市科技计划项目（2019030001、2019030012）
摘要

目的 建立溺死尸体脏器气单胞菌气溶素（ aerA）和溶血素（ hlyA）两基因的PCR-CE检测方法,验证该方法的特异性和灵敏度,并探讨其在溺死诊断中的应用价值。方法 设计气单胞菌（Aeromonas）特异性引物aer-A1和hlyA-1,构建PCR-CE方法;扩增52种标准株DNA;确定最低DNA检测浓度;检测16只实验猪和40例真实案件尸体组织样本,分别计算两对引物总阳性率。结果 引物aerA-1可特异性扩增杀鲑气单胞菌和温和气单胞菌,产物片段为180bp,灵敏度分别为0.034、0.92ng;引物hlyA-1可特异性扩增杀鲑气单胞菌和嗜水气单胞菌,产物片段为150bp,灵敏度分别为0.94、0.034ng。利用aerA-1检测溺死实验猪和真实案件尸体组织样本,溺死阳性率分别为70.00%、78.38%;利用hlyA-1检测溺死实验猪和真实案件尸体组织样本,溺死阳性率分别为80.00%、83.78%。结论 基于气单胞菌aerA基因和hlyA基因建立的PCR-CE检测方法进行溺死诊断,快速灵敏,特异性好,有良好的应用前景。

关键词: 法医学; 溺死诊断; 聚合酶链式反应-毛细管电泳; 气单胞菌; aerA基因; hlyA基因
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2021)02-0111-08
Applicability of Aeromonas Genes of aerA and hlyA into Diagnosis of Drowning
XIAO Cheng1,2, ZHU Xiaolin3, XU Quyi1,3, HAN Yali3, LI Yue1, YU Zhonghao1,2, LI Huan1,4, PENG Fan3, LIU Xiangdong3, LIU Chao1,2,*
1. Guangzhou Forensic Science Institute/Key Laboratory of Forensic Pathology of Ministry of Public Security, Guangzhou 510442, China
2. School of Forensic Science, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
3. College of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006, China
4. College of Basic Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
Abstract

Objective To establish a PCR-CE method for detection of Aeromonas genes, aerolysin ( aerA) and hemolysin ( hlyA), from the tissues of drowning cadavers along with the specificity and sensitivity being tested for the evaluation of its forensic applicability into drowning diagnosis.Methods Targeted to the conserved sequences of Aeromonas, the specific primers (aerA-1 and hlyA-1) were designed for amplification of the purposed genetic fragments. 52 species were respectively tested to verify the specificity of the amplified fragments, with the sensitivity being measured through the DNA of positive control samples. The positive rate of aerA-1 and hlyA-1 was calculated from detection into the 16 experimental pigs and 40 cadavers.Results Primer aerA-1 was able to specifically amplify Aeromonas salmonicida and Aeromonas veronii, resulting in its PCR products of 180bp and the sensitivity of 0.034ng and 0.92ng for the two bacteria, respectively. Likewise, primer hlyA-1 amplified Aeromonas salmonicida and Aeromonas hydrophila specifically, having its PCR products of 150bp and the sensitivity of 0.94ng and 0.034ng for the related two bacteria. The aerA-1 showed its positive rate of individual 70.00% and 78.38% in detecting the drowning experimental pigs and cadavers; so did the primer hlyA-1 of 80.00% and 83.78%, respectively.Conclusion Through detection of Aeromonas genes of aerA and hlyA, the established PCR-CE approach is eligible for drowning diagnosis, demonstrating its fast, sensitive and specific prominence, having good applicative prospect for forensic utilization.

Key words: forensic medicine; diagnosis of drowning; PCR-CE (capillary electrophoresis); Aeromones; hlyA gene; aerA gene

水中尸体死因鉴定是法医学的重点和难点[1, 2, 3]。迄今, 国内外大部分法医工作者使用硅藻检验法, 根据光学显微镜下脏器组织中硅藻的形态和数量诊断溺死, 该法历史悠久、操作简单, 但是缺点也明显, 不仅检验阳性率低, 且操作过程易受污染[4-8]。

近年来, 又有研究者利用虚拟解剖技术研究溺死[9, 10], 但其实践性、普及性较差; 通过对传统的硅藻检验进行改良, Zhao等[11]建立的微波消解-真空抽滤-自动扫描电镜法（microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy, MD-VF-Auto SEM）, 检测灵敏度高, 可定性定量, 但该法所需仪器设备价格高昂, 对检验人员的专业水平要求也较高[12]。

在溺死过程中, 除硅藻外, 还有大量水生微生物会随着溺液进入死者的肺组织及血液循环。目前, 溺死相关微生物的DNA检测已经成为法医学研究的新热点[13], 国内外已有不少检测硅藻特异性靶基因的研究, 例如rbcL基因、SSU基因、ITS基因、COI基因以及18S rDNA等[14, 15, 16, 17, 18]。针对蓝藻、绿藻、甲藻以及水生细菌的靶基因检测亦有研究报道[19, 20, 21, 22, 23]。与硅藻相比, 水生细菌的体积更小（硅藻：2~20 μ m, 水生细菌：0.2~2.0 μ m）, 在溺死过程中, 更容易经由肺泡进入溺水者血液循环[24]。以PCR扩增为核心的水体微生物DNA检测方法拥有快速、灵敏、高通量的特点, 对于水中尸体的溺死鉴定具有重要的帮助作用, 应用前景广阔[25]。使用选择性琼脂培养基培养源自水中尸体心血的微生物, 以16S rDNA引物进行扩增, 再对扩增产物进行测序, 经blast比对和同源性分析, Kakizaki等[26]确认海水细菌可作为海水溺死的特异性标记物。

针对淡水和海水细菌, Uchiyama等[27]设计了9对特异性引物, 构建了多重荧光TaqMan实时荧光定量PCR法, 并通过检测266份尸体样本, 确认该方法检测水生细菌具有较高的灵敏度、特异性和检测通量, 并且检测操作简单、过程耗时较少。麦柏盛等[28]使用的PCR-CE联合法检测嗜水气单胞菌gyrB和16S rRNA基因, 在溺死尸体脏器组织中的检出率达82.1%, 可作为溺死鉴定的有效方法。

水中的浮游细菌, 以气单胞菌最为常见, 数量最多, 广泛存在于各种环境水体中[29]。气溶素基因（aerA）和溶血素基因（hlyA）是气单胞菌的特异性基因, 具有较高种属内序列同源性[30, 31]和保守性, 可作为溺死鉴定的特异性靶基因。目前国内外尚未有专门针对其进行检测而鉴定溺死的研究。因此, 本文选择气单胞菌的aerA和hlyA基因设计特异性引物, 拟构建一种快速、灵敏、特异的PCR-CE检测方法, 以提供一个除硅藻检验外的水中尸体死因鉴定技术手段, 以及更多的溺死诊断证据信息。

1 材料和方法
1.1 仪器与试剂

高速冷冻离心机（Sigma）, Thermomixer Vortex 振荡仪及恒温混匀仪（Eppendorf）, VeritiTM 96孔热循环仪、ProFlexTM PCR系统和3130xL遗传分析仪（Thermo Fisher Scientific）, Qubit® fluorometer 2.0荧光定量仪（Invitrogen）, MF-F涡旋混合器（Scilogex）, Milli-Q超纯水系统（Millipore）, 高压蒸汽灭菌锅（Hirayama）。

PowerSoilTM DNA Isolation Kit及20 mg/mL蛋白酶 K（Qiagen）, Qubit dsDNA HS Assay Kit、POP-4胶、Buffer（10× ）EDTA缓冲液、甲酰胺和CC5 ILS500内标（Thermo Fisher Scientific）, Premix TapTM（Takara）, DTT（Promega）, 96 孔PCR板和电泳板（Axygen）。

1.2 样本

1.2.1 标准藻株、菌株及人的基因组DNA

长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）、大肠杆菌（Escherichia coli）和白色念珠菌（Candidaalbicans）等3种人体共生菌, 嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、温和气单胞菌（Aeromonas sobria）、杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）和舒氏气单胞菌（Photobacteriu mleiognathi）等5种气单胞菌, 以及哈氏弧菌（Vibrio harveyi）、副溶血性弧菌（Vibrio Parahaemolyticus）、鲇爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）和赫氏埃希菌（Escherichia hermannii）等4种其他水生细菌均购自广东省微生物研究所。针杆藻（Synedra radians）、舟形藻（Navicula sp.）、直链藻（Melosiravarians）、小环藻（Cyclotella sp.）、菱形藻（Nitzschia sp.）、异极藻（Gomphonema sp.）、脆杆藻（Fragilaria sp.）、桥弯藻（Cymbellagracilis）、蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、普通小球藻（Chlorella vulgaris）、斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）、镰形纤维藻（Ankistudesmus sp.）、念珠藻（Nostoc sp.）、鱼腥藻（Anabaena sp.）、单歧藻（Tolypothrix sp.）、柔细束丝藻（Aphanizomenon gracile）、产毒铜绿微囊藻（Toxic microcystis）、不产毒铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）、纤细裸藻（Euglena gracilis）、盾形甲藻（Peridiniopsis sp.）和衣藻（Chlamydomonas）等21种淡水藻均购自中国科学院水生生物研究所。中肋骨条藻（Skeletonema costatum）、威氏海链藻（Thalassiosira weissflogii）、旋链毛角藻（Chaetoisceros curvisetus）、多列拟菱形藻（Pseudonitzschia multi）、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）、亚心扁藻（Platymonas subcordiformis）、杜氏盐藻（Dunaliella salina）、小球藻（Chlorella sp.）、四爿藻（Tetraselmis sp.）、卵囊藻（Oocystis）、聚球藻（Synechococcus）、钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）、隐秘小环藻（Cyclotella cryptita）、伊姆裸甲藻（Gymnodinium impudicum）、链状亚历山大藻（Alexandrium catenella）、海洋原甲藻（Prorocentrum micans）和血红哈卡藻（Akashiwo sanguinea）等17种海水藻均购自厦门浠柏生物有限公司。人类女性基因组DNA 9947A购自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2.2 实验猪及尸体样本

根据动物实验伦理规定, 本实验选取16只蕨麻小型猪, 不分雌雄, 体重在15~30 kg之间, 由广州市饲料研究所实验动物中心提供（合格证号：[SCXK（粤）2015-0036]）。

实验猪随机分为甲、乙、丙三组：甲组为陆地处死组（n=3）, 在远离水的陆地上采用窒息手段处死; 乙组为溺死组（n=10）, 将实验猪置于猪笼中, 沉入水下0.5 m 1 min, 提出水面30 s再重新沉入相同水深处, 重复3~5次使实验猪缓慢溺死, 死后在水下1 m处浸泡30 min; 丙组为死后浸泡组（n=3）, 在陆地上窒息处死后浸泡于湖水中48 h。为提高检出率及减少随机误差, 采用一次性器械解剖, 每只实验猪分别统一提取血流丰富的右肺尖叶中部组织、肝左内叶中部组织、左肾上部皮质组织均0.5 g, 同时, 收集溺死地水样5 L, -20 ℃保存备用。

从广州市刑事科学技术研究所的日常检案中, 筛选出40例已经做过MD-VF-Auto SEM法硅藻检验的案件尸体样本（37例为溺死, 3例为自然死亡）, 取得家属知情同意书后, 剪取尸体肺、肝、肾三脏器组织各0.5 g, -20 ℃保存备用。

1.3 DNA提取及定量

采用PowerSoilTM DNA Isolation Kit试剂盒提取DNA。对藻株和菌株培养液各取1 mL加入到含有细胞裂解液及研磨珠的PowerBread管中, 10 000 g离心30 min, 弃上清液0.5 mL; 针对脏器组织样本, 分别取0.5 g, 置于PowerBread管中, 采用一次性器械剪碎, 然后于其中加入10 μ L蛋白酶K和10 μ L DTT; 恒温振荡仪56 ℃振荡3 h, 振幅为1 500 r/min。根据试剂盒说明书, 按流程提取DNA。

以Thermo Fisher Scientific公司Qubit荧光定量试剂盒制作标准曲线：1 μ L样品DNA, 199 μ L工作液, 振荡离心, 室温避光孵育3 min, 参考标准曲线, 测定DNA浓度。

1.4 引物设计及PCR扩增

选取GenBank数据库中气单胞菌特异性的aerA基因（检索号：EF450825.1; M16495.1）和hlyA基因（检索号：KF786302.1; KF483996.1; KU845730.1; KU845731.1）, 使用引物设计软件Primer Express3.0.1设计特异性引物, 经过NCBI中Primer-BLAST的引物特异性验证, 最终筛选出两条高度特异的引物：aerA-1和hlyA-1（表1）。以蓝色荧光FAM标记引物5′ 端, 委托上海生物工程技术服务有限公司合成该引物。

表1 筛选所得的引物序列及其特征 Table 1 The selected primer sequences and the characteristics of their corresponding gene fragments

采用20 μ L的PCR扩增体系：Pre-mix Taq 10 μ L, 正反向引物各0.75 μ L（浓度均为10 μ mol/L）, 超纯水7.5 μ L, DNA模板1 μ L。

PCR热循环参数：94 ℃10 min; 94 ℃40 s, 58 ℃30 s, 72 ℃40 s, 35个循环; 72 ℃10 min。

1.5 毛细管电泳检测

使用3130xL遗传分析仪对PCR扩增产物进行毛细管电泳分离。上样体系由CC5ILS500内标、扩增产物和甲酰胺按照1:1:10的比例均匀混合而成, 95 ℃变性3 min, 立即置于冰上冷却3 min后检测。

1.6 引物特异性及灵敏度实验

分别使用引物aerA-1和hlyA-1, 扩增人类基因组DNA 9947A、猪基因组DNA以及所提取的3种人体共生细菌、5种气单胞菌、4种其他水生细菌、21种淡水藻和17种海水藻的DNA, 以毛细管电泳检测, 验证引物特异性。

采用Qubit荧光定量仪检测所提取的标准藻株及菌株DNA浓度, 对10× 倍比稀释的8个浓度梯度, 经PCR-CE检测, 分别确定引物aerA-1和hlyA-1对各种模板DNA的扩增检测下限。

1.7 阳性率实验

分别由引物aerA-1和hlyA-1, 经PCR-CE检测实验猪和案件尸体的脏器组织, 参照法医学鉴定硅藻检验的阳性标准, 以肺并肝、肾任一脏器检出气单胞菌为溺死阳性, 计算两对引物的溺死阳性率。

1.8 扩增产物测序

从引物aerA-1和hlyA-1构建的PCR-CE法检测为阳性的扩增产物中, 分别随机挑选一例, 委托上海生物工程有限公司测序, 所得序列于NCBI的nr数据库中作BLAST比对, 进行同源性分析。

1.9 统计学分析

采用SPSS24.0作统计分析, 根据数据分布形式, 选择配对卡方检验（McNemar test）和kappa一致性检验比较引物aerA-1和hlyA-1所构建的PCR-CE法对于气单胞菌的检出率是否具有显著性差异。若检验水准α =0.05, P< 0.05, 则为差异具统计学意义。

2 结果
2.1 特异性和灵敏度

分别以引物aerA-1和hlyA-1扩增人类基因组DNA、猪基因组DNA、3种人体共生细菌、5种气单胞菌、4种其他水生细菌、21种淡水藻及17种海水藻, 后经毛细管电泳分离扩增产物。

结果显示, 引物aerA-1仅能扩增检测杀鲑气单胞菌和温和气单胞菌, 产物片段均为180 bp, 其对DNA模板的扩增检测下限分别为0.034、0.92 ng。引物hlyA-1仅能检测杀鲑气单胞菌和嗜水气单胞菌, 扩增产物片段均为150 bp, 其对DNA模板的扩增检测下限分别为0.94、0.034 ng。

2.2 实验猪检测结果

分别以引物aerA-1和hlyA-1构建的PCR-CE法检测实验猪肺、肝、肾组织及溺死所用水样。结果表明, 死后浸泡组和陆地处死组的肺、肝、肾脏均未有检出, 而10只溺死实验猪脏器组织和溺死所用水样均有不同程度的检出（表2）。引物aerA-1和hlyA-1对溺死猪脏器组织与水样（n=40）的总体检出差异情况见表3。

表2 引物aerA-1和hlyA-1在溺死猪不同样本中的PCR-CE检出结果（n=10） Table 2 The PCR-CE results from primer aerA-1/hlyA-1 leading the amplification into different samples of drowning pigs (n=10)
表3 引物aerA-1和hlyA-1在溺死猪所有样本中的PCR-CE检出结果（n=40） Table 3 The PCR-CE results from primer aerA-1/hlyA-1 launching the amplification into all the samples of drowning pigs (n=40)

根据数据类型, 选择配对卡方检验（McNemar test）和Kappa一致性检验, 比较上述两对引物所构建的PCR-CE法在检测气单胞菌上的阳性率差异, 结果表明引物aerA-1和hlyA-1对溺死实验猪样本的检测差异均不具有统计学意义（P=0.250> 0.05）, 该两对引物的检测结果一致性较高（0.6< kappa=0.795< 0.8, P< 0.05）。

2.3 案件尸体样本检测结果

分别以引物aerA-1与hlyA-1构建的PCE-CE法, 检测溺死尸体的肺、肝、肾组织。

结果表明, 引物aerA-1与hlyA-1的溺死阳性率分别为78.38%、83.78%, 见表4。引物aerA-1和hlyA-1在溺死尸体脏器组织（n=111）的总体检出差异情况见表5。

表4 引物aerA-1与hlyA-1在溺死尸体不同样本中的PCR-CE检出结果（n=37） Table 4 The PCR-CE results from primer aerA-1/hlyA-1 igniting the amplification into different samples of drowning corpse (n=37)
表5 引物aerA-1和hlyA-1在溺死尸体所有样本中的PCR-CE检出结果（n=111） Table 5 The PCR-CE results of primer aerA-1/hlyA-1 directing the amplification into all the samples of drowning corpse (n=111)

在案件尸体样本中, 有3例为自然死亡, 引物aerA-1与hlyA-1构建的PCR-CE法检测其肺、肝和肾, 结果均为阴性, 表明正常尸体的肺、肝和肾内均不含气单胞菌, 与实际案情相符。根据数据的类型, 选择配对卡方检验和Kappa一致性检验, 比较上述两对引物所构建的PCR-CE法对检测气单胞菌的阳性率差异, 结果表明引物aerA-1和hlyA-1对溺死尸体样本的检测差异不具有统计学意义（P=0.180> 0.05）, 这两对引物的检测结果一致性较高（0.6< kappa=0.788< 0.8, P< 0.05）。

2.4 扩增产物测序结果

分别从引物aerA-1、hlyA-1的阳性扩增产物中随机抽取1例测序。

引物aerA-1扩增产物测序序列为：

ATGGGGGGAAGGTAAGGCGAGTTGGTGACCTTGATGGCGGGTCTTGTCACCACAGCGATAGCCGTCACAGCCGCCGTCATTG
TTGCCACGGATCACCCAGCCGTCGCCATCACGGGTCACATATCCATGTCTTCACCGACATATTGGCTGTGATTGCCGAA。

引物hlyA-1扩增产物测序序列为：

GAGGCGGGGGGTGTGGATCCACGTCGTAGCCCATGCCCCAGACGGTGGCCGTCTTGGAGGAGAGCAGGGACTCCGCGGTC
GCGTATTGATCGCGCACCCAGCTGAAACTCACCTTCTGGGCACA。

图1为两引物扩增产物的测序图谱。

图1 引物的PCR产物测序图谱（左:引物aerA-1; 右:引物hlyA-1）Fig.1 The spectrums from sequencing the PCR product of primer aerA-1(left)/hlyA-1(right)

将引物aerA-1和hlyA-1的扩增产物测序所得序列, 置于NCBI的nr数据库中作BLAST比对, 进行同源性分析。结果表明两者分别与气单胞菌aerA基因（ID：KF312438.1）和hlyA基因（ID：KU764629.1）同源, 序列匹配度达99.00%, 证明这两对引物分别对气单胞菌的aerA、hlyA基因进行了特异性扩增, 提示引物aerA-1和hlyA-1所构建的PCR-CE法可用于水中尸体的死因鉴定。

3 讨论

在溺死者的血液、器官组织内检测比硅藻更小的水生微生物（如细菌等）, 寻找更多的溺死相关特异性靶基因, 是当前分子生物学方法检测溺死的主要研究方向[32]。

气单胞菌是水中的主要浮游细菌, 广泛分布于各种水体中, 可作为溺死检测的特异性标记物[33, 34]。aerA和hlyA基因是气单胞菌产毒因子的必要编码基因, 普遍存在于气单胞菌中。

此外, aerA、hlyA基因在种属之间的同源性仅为46.70 %, 且具有较高保守性, 又可用于气单胞菌的种属区分[35]。因此, 本文选择气单胞菌的hlyA基因和aerA基因作为溺死检测的靶基因, 分别构建高效、准确、特异的气单胞菌PCR-CE检测方法。扩增产物序列BLAST比对结果表明, 本文所设计的引物aerA-1和hlyA-1分别与杀鲑气单胞菌aerA和hlyA基因的匹配度最高, 说明这两对引物针对杀鲑气单胞菌的aerA和hlyA基因进行了特异性扩增, 具有高度特异性。

特异性实验结果表明, 引物aerA-1仅能扩增检测杀鲑气单胞菌和温和气单胞菌, 引物hlyA-1仅能检测杀鲑气单胞菌和嗜水气单胞菌, 且它们的PCR产物片段均较小（< 200 bp）。两对引物对维氏气单胞菌、舒氏气单胞菌、人基因组DNA、猪基因组DNA、3种人体共生细菌、4种其他浮游细菌、21种淡水藻以及17种海水藻的基因组检测结果均为阴性。相较于引物hlyA-1, aerA-1检测杀鲑气单胞菌的灵敏度更高, 最低检测量为0.034 ng。麦柏盛等[28]构建的PCR-CE法仅能针对嗜水气单胞菌的gyrB基因和16S rRNA基因检测, 而本文方法所设计的引物可特异性扩增多种水生气单胞菌, 特异性实验所验证的标准藻株、菌株涵盖了大部分国内外相关文献涉及的溺死诊断特异性微生物, 共验证了52个物种, 既扩大了溺死相关靶向标记的检测范围, 又进一步确认了方法的特异性, 从而提升了溺死相关水生气单胞菌的整体检测能力。

此外, 检测同一类水生气单胞菌的不同靶基因, 结果可相互印证。使用引物aerA-1和hlyA-1构建的PCR-CE方法, 分别检测陆地处死组及死后浸泡组实验猪的不同脏器组织, 结果均为阴性。针对溺死组实验猪, 这两对引物都能在溺死实验水样中检出气单胞菌, 而其在脏器组织的总溺死阳性率分别是70%和80%, 经统计学分析, 这两对引物的检测结果一致性较高（0.6< kappa=0.795< 0.8, P< 0.05）, 表明这两种PCR-CE方法均能有效鉴定溺死与非溺死。本文方法检测3例自然死亡尸体脏器组织, 结果均为阴性; 针对37例溺死尸体样本, 总溺死阳性率分别为78.38%和83.78%, 两者检测结果一致性较高（0.6< kappa=0.788< 0.8, P< 0.05）。

在溺死鉴定中, 除了肺为阳性外, 肝肾任一体循环脏器为阳性, 才能鉴定为溺死, 在本研究中, 无论是溺死的实验猪, 还是案件中溺死尸体样本, 肝脏和肾脏的气单胞菌阳性率均远低于肺脏, 而因此导致总体的检测阳性率约为80%。可能的原因是, 在溺死的过程中, 气单胞菌从溺死水样中进入肺脏, 被肺脏稀疏的组织结构所吸附, 随血液进入体循环的量较少, 因此肝肾等远端器官气单胞菌的含量较少, 其检出率相对肺脏较低。

溺死尸体样本肺组织气单胞菌及硅藻含量相对较为丰富, 因此, 本研究将引物aerA-1、hlyA-1以及MD-VF-Auto SEM法对溺死尸体肺组织的检测阳性率进行了比较, 结果表明, 三者之间阳性率的差异没有统计学意义（χ 2= 2.05, P> 0.05）。使用MD-VF-Auto SEM法检验死者脏器组织的硅藻, 需消耗大量脏器组织, 实验过程中还会产生有害气体污染环境, 且微波消解仪与扫描电镜价格昂贵, 不适宜在基层实验室进行推广应用。本文所建立的PCR-CE法, 检材消耗量较少, 检测灵敏度较高, 实验过程不会对环境造成污染, 而所用的PCR扩增仪、毛细管电泳仪为法医DNA检验实验室的常用仪器设备, 故检测成本较低, 适宜在大部分法医实验室推广应用。

水中尸体是法医学尸体检验的常见材料, 在尸体脏器组织中检出硅藻被认为是明确的溺死指标, 硅藻检验结果呈现较为直观, 不仅能清晰地观察到脏器组织中硅藻的形态及数量, 还能辨明其种属, 其作为法庭证据历史悠久。然而, 硅藻在自然界广泛存在, 居住于空气潮湿地区、经常食用水产品的人群以及使用硅藻土作业的装修工人, 其脏器组织也可能会有硅藻外壳的沉积, 对于这类人群使用硅藻检验进行溺死鉴定就存在误判的风险。

本文所构建的气单胞菌aerA、hlyA基因检测法, 是核酸检验, 故对于检测范围中的嗜水气单胞菌, 因其存在于自然界的各种水体, 既为多种水生动物的原发性致病菌, 也是典型的人-兽-鱼共患病病原菌, 所以, 水产作业者、游泳人员、病菌感染者等人群, 其脏器组织也可能有嗜水气单胞菌, 故运用该方法进行溺死鉴定也有误判的风险。因此, 对于水中尸体, 同时进行硅藻检验及气单胞菌检测, 不仅能相互验证检测结果, 还可显著提高溺死鉴定的准确性及法庭证据力, 降低可能的误判风险。

综上所述, 本文建立的气单胞菌hlyA基因和aerA基因诊断溺死的PCR-CE法, 具有特异性强、灵敏度高、耗时短、通量大、操作便捷等优点, 可作为溺死鉴定的重要辅助手段, 且还可与其他溺死鉴定方法互相佐证, 从而提供更多的溺死诊断证据信息, 具有良好的法医学应用前景。

参考文献
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