DGU-20A 高效液相色谱（日本岛津公司）; 4000 Q Trap 液 相 色 谱 - 质 谱 联 用 仪（美 国 AB
SCIEX 公司）; 6770 冷冻研磨仪（美国SPEX CertiPrep公司）; 撞子式研磨仪（中国北京万孚公司）; Quanta 650扫描电子显微镜（美国FEI公司）; TB-215D十万分之一电子天平（美国丹佛公司）; KQ-600超声波清洗器（中国昆山超声仪器公司）。甲基苯丙胺标准品（公安部物证鉴定中心, ^{[1.0± 0.03]} mg/mL）; 苯丙胺标准品（公安部物证鉴定中心, ^{[1.0± 0.03]} mg/mL）; 甲醇、乙腈、甲酸、甲酸铵等试剂均为色谱纯, 水为去离子水。

取1.0 mg/mL的甲基苯丙胺、苯丙胺标准品, 用甲醇稀释, 分别配制成10 μ g/mL的标准储备液, 置于4 ℃冰箱中保存; 取适量甲基苯丙胺、苯丙胺标准储备液用甲醇配制成浓度为10、100 ng/mL的甲基苯丙胺、苯丙胺混合标准溶液, 在制作空白指甲加标样品时作为加标溶液使用。

实验采用未吸毒人员的指甲作为空白指甲。向经冷冻研磨后的空白指甲粉末中加入适当体积的10或 100 ng/mL甲基苯丙胺、苯丙胺混合标准溶液, 混匀平衡24 h后, 氮气吹干, 使加标指甲样品中甲基苯丙胺、苯丙胺的最终加标量分别为0.2、0.5、1、5、10、25 ng/mg。

1.4.1 脱污染处理

样品用0.1%的十二烷基磺酸钠水溶液超声15 min, 依次使用去离子水、甲醇对样品清洗各3次, 置于室温下晾干。

1.4.2 破碎处理及溶剂提取

使用冷冻研磨仪研磨（循环2次, 每次2 min）, 将研磨后的指甲粉末分成每份10 mg, 待检。将指甲粉末加入1 mL甲醇充分混旋, 超声振荡20 min后, 8 000 r/min离心10 min, 取上清液用0.22 μ m微孔滤膜过滤。

1.5.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm × 50 mm, 5 μ m）; 进样体积1 μ L; 流速0.8 mL/min; 柱温：40 ℃; 流动相A为乙腈, 流动相B为含0.1%（体积分数）甲酸的5 mmol/L甲酸铵溶液; 洗脱梯度详见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 梯度洗脱条件 Table 1 Conditions for gradient elution 时间/min A/% B/% 流速/（mL/min） 0.5 10 90 0.8 5.0 60 40 0.8 6.0 60 40 0.8 6.1 10 90 0.8 6.5 10 90 0.8

表1 梯度洗脱条件 Table 1 Conditions for gradient elution

1.5.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）, 正离子模式, 多反应监测模式（MRM）, 电离电压5 500 V, 离子源温度550 ℃, 雾化气压力55 psi。两种物质的质谱参数详见表2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 甲基苯丙胺和苯丙胺的检测参数 Table 2 Mass spectral parameters of methamphetamine and amphetamine 名称 定性离子 定量离子 去簇电压/V 碰撞能/V 甲基苯丙胺 150.1/91.0 150.1/119.0 150.1/91.0 50 50 24 15 苯丙胺 136.0/91.0 136.0/119.1 136.0/91.0 43 43 22 12

表2 甲基苯丙胺和苯丙胺的检测参数 Table 2 Mass spectral parameters of methamphetamine and amphetamine

本文考察了甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、甲醇-含0.1%甲酸的5 mmol/L甲酸铵溶液、乙腈-含0.1%酸的5 mmol/L甲酸铵溶液四种流动相体系, 发现使用乙腈-含0.1%甲酸的5 mmol/L甲酸铵溶液体系时, 两目标物得到有效分离, 同时峰展较窄, 峰形最好, 这表明甲酸铵作为流动相改良剂与甲酸形成了缓冲盐体系, 减少了次级保留, 起到了改善峰形、提高分离度的作用。实验还发现, 乙腈对目标物有更好的分离选择性。因此, 本文选用乙腈-含0.1%甲酸的5 mmol/L甲酸铵溶液作为流动相。

2.2.1 破碎方式

由于指甲高硬性、高韧性的特点, 破碎处理过程较为困难。将同一指甲样品均匀分为三份, 分别采用冷冻研磨、撞子式常温研磨（撞子为陶瓷珠）、剪碎三种破碎方式处理后, 取适量样品用扫描电子显微镜（SEM）观察微观形貌。同时, 将以上样品分别称取10 mg, 按1.4步骤用甲醇提取, 进LC-MS/MS分析。采用冷冻研磨、撞子式常温研磨和剪碎处理后指甲颗粒的SEM图见图2。对比SEM图发现, 采用剪碎的方式处理检材, 指甲颗粒平均粒径均在1 mm左右; 使用撞子式研磨仪进行常温研磨, 指甲颗粒大小不一, 粒径在100~500 μ m之间; 采用冷冻研磨的处理方式, 可以将指甲研磨至粒径为10 μ m左右的粉末状态。对比三种破碎方式处理后指甲样品提取溶液中两种目标物经LC-MS/MS分析的峰面积值, 见表3。结果显示, 三种处理方法中提取溶液目标物峰面积最高的是冷冻研磨, 其次是撞子式常温研磨, 峰面积最低的是剪碎处理。这表明冷冻研磨法的提取效果明显高于撞子式常温研磨和剪碎处理。结合LC-MS/MS和SEM分析结果, 说明指甲样品破碎处理后粒径越小, 比表面积越大, 溶剂与检材颗粒有效接触面积越大, 提取效果越好。综上所述, 三种破碎方式中最适合选用冷冻研磨法对指甲进行处理。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 三种不同方式处理后提取溶液中甲基苯丙胺、苯丙胺的峰面积 Table 3 Peak area of methamphetamine and amphetamine from extraction solution after three different treatments 目标物 指甲中目标物峰面积/e4 冷冻研磨 常温研磨 剪碎 甲基苯丙胺 1398.3 249.97 129.00 苯丙胺 7.3742 5.0402 1.6380

表3 三种不同方式处理后提取溶液中甲基苯丙胺、苯丙胺的峰面积 Table 3 Peak area of methamphetamine and amphetamine from extraction solution after three different treatments

2.2.2 提取方式

本文考察了甲醇、乙腈、乙醚、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯等6种常见有机溶剂对指甲中甲基苯丙胺、苯丙胺的提取效果。准确称取加标量为10 ng/mg的加标指甲样品6份, 分别用以上6种有机溶剂按1.4步骤进行有机溶剂提取, 进LC-MS/MS分析。结果表明, 甲醇提取指甲中甲基苯丙胺、苯丙胺效果最好, 提取回收率最高（表4）。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 6种有机溶剂的回收率 Table 4 Recoveries from six kinds of organic solvent 目标物 回收率/% 甲醇 乙腈 乙醚 异丙醇 丙酮 乙酸乙酯 甲基苯丙胺 87.3 60.5 70.2 65.6 66.1 -- 苯丙胺 90.1 57.7 67.1 66.5 -- 36.8 注：--表示目标物峰出现严重拖尾, 无法准确计算回收率

表4 6种有机溶剂的回收率 Table 4 Recoveries from six kinds of organic solvent

制备甲基苯丙胺、苯丙胺的加标指甲样品, 按本文方法进行分析检测, 同时做空白指甲的对照试验, 将二者的图谱进行比较（见图3、图4）。结果在甲基苯丙胺、苯丙胺保留时间附近, 空白指甲均未出现明显的色谱峰, 表明指甲检材中内源性杂质不会对甲基苯丙胺、苯丙胺的测定造成干扰, 说明本文方法具有较高的专属性。

图2

Fig.2

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	图2 冷冻研磨（a）、常温研磨（b）和剪碎（c）后的指甲颗粒扫描电镜图Fig.2 SEM photographs of the grained nail from frozen grinding (a), normal temperature grinding (b) and shearing (c)

图3

Fig.3

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	图3 空白指甲MRM色谱图Fig.3 MRM chromatogram of blanknail

图4

Fig.4

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	图4 指甲添加甲基苯丙胺、苯丙胺MRM色谱图Fig.4 MRM chromatograms of methamphetamine and amphetamine from spiked nail

本文使用提取后加入法测试了基质效应的影响, 即分别配制标准品溶液和空白指甲基质提取液添加标准品溶液, 测定两者中目标物色谱峰面积为S_b、S_k, 以峰面积比值S_k /S_b(%)来评价基质效应带来的影响。实验配置的溶液分为低、中、高三个浓度, 分别为10、100、250 ng/mL, 按照1.4处理方法分别对应加标量为1、10、25 ng/mg的指甲样品。测试结果显示, 在低、中、高三个浓度时, 甲基苯丙胺和苯丙胺的基质效应分别在92.3%~101.5%和91.6%~103.8%之间, 本方法基质效应不明显。

取系列浓度加标指甲样本, 按1.4 步骤处理, 以1.5仪器条件检测, 每个浓度平行三份。以加标指甲浓度对两目标物定量特征离子峰面积做线性回归, 求得甲基苯丙胺、苯丙胺线性回归方程分别为y=242 149x+39 234（R²=0.999 1）, y=92 733x-17 622（R²=0.998 8）。结果表明指甲中的甲基苯丙胺、苯丙胺在0.2~25 ng/mg浓度范围内有着良好的线性关系。以工作曲线最低点浓度0.2 ng/mg作为方法的定量限 (LOQ), 以信噪比S/N> 3/1计, 本方法两种目标物最小检出限(LOD)均低于0.05 ng/mg。

取空白指甲粉末添加甲基苯丙胺、苯丙胺混合标准溶液制备浓度为1、10、25 ng/mg的加标指甲样品。每个浓度平行取样6份, 按照1.4步骤处理, 以1.5仪器条件检测, 测得回收率见表5。按同样方法配制上述三种浓度的加标指甲样品, 每个浓度平行取样6份, 在一日内早、中、晚三个时间进行仪器检测, 计算样本峰面积的相对标准偏差, 得到日内精密度。连续3 d重复此实验, 计算目标物峰面积的相对标准偏差, 得到日间精密度, 见表5。结果表明, 本检测方法具有良好的提取回收率和精密度。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 指甲样本中甲基苯丙胺和苯丙胺的回收率及精密度（n=6） Table 5 Precision and recovery of methamphetamine and amphetamine from nail samples (n=6) 目标物 空白指甲添加浓度/（ng/mg） 精密度RSD/% 回收率% 日内 日间 甲基苯丙胺 1 3.54 4.31 85.1 10 2.99 2.93 87.6 25 2.53 3.49 91.4 苯丙胺 1 3.95 6.67 86.7 10 3.83 5.46 89.0 25 4.05 4.56 91.5

表5 指甲样本中甲基苯丙胺和苯丙胺的回收率及精密度（n=6） Table 5 Precision and recovery of methamphetamine and amphetamine from nail samples (n=6)

采用冷冻研磨结合LC-MS/MS法分别对本地案件中20份涉嫌吸食甲基苯丙胺的嫌疑人指甲样品进行检验分析, 其中同时检出甲基苯丙胺、苯丙胺成分的17例, 未检出甲基苯丙胺成分的3例。以上样品中, 甲基苯丙胺含量低于10 ng/mg的样品3例, 含量在10 ~25 ng/mg的样品9例, 含量高于25 ng/mg的样品5例。结果表明本文方法检测甲基苯丙胺滥用者指甲中甲基苯丙胺、苯丙胺成分, 检出率高, 方法适用性良好。