引用本文
陈维忠, 王鑫, 张健, 石云杰, 马温华, 丁光树, 陆文俊, 王皋, 姜颖晔, 周如华. 猪骨组织的鉴定应用[J].刑事技术, 2020,45(5):534-537
CHEN Weizhong, WANG Xin, ZHANG Jian, SHI Yunjie, MA Wenhua, DING Guangshu, LU Wenjun, WANG Gao, JIANG Yingye, ZHOU Ruhua. Identification of Pig Osseous Tissue[J]. Forensic Science and Technology,2020,45(5): 534-537  
Doi: 10.16467/j.1008-3650.2020.05.020
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猪骨组织的鉴定应用
陈维忠1,2, 王鑫1, 张健1, 石云杰1, 马温华2, 丁光树2, 陆文俊3, 王皋3, 姜颖晔3, 周如华1,*
1.苏州市公安局物证鉴定所,江苏 苏州 215131
2.公安部物证鉴定中心,北京 100038
3.无锡中德美联生物技术有限公司,江苏 无锡 214174

* 通讯作者简介：周如华,男,安徽定远人,学士,副主任法医师,研究方向为法医物证学。E-mail: 13961329595@139.com

第一作者简介：陈维忠,男,浙江永康人,硕士,主检法医师,研究方向为法医物证学。E-mail: 328212140@qq.com

基金资助: 公安部物证鉴定中心开放课题基金资助项目（2017CSEEKFKT07）
摘要

目的 对一份来源于案件现场的骨质样本,鉴定其种属来源。方法 使用磁珠法提取骨质样本中的DNA,再经法医鉴定试剂盒AGCU Expressmarker22进行扩增,根据结果再以肉源种属鉴定试剂盒对提取的DNA进行扩增,判断其中的种属性成分,最后进行AGCU猪源性成分检测试剂盒荧光定量PCR复测。结果 使用AGCU Expressmarker22扩增试剂盒对各基因座检测均无扩增峰出现,使用肉源种属鉴定试剂盒扩增显示其中含有猪源性成分,AGCU猪源性成分检测试剂盒荧光定量PCR复测结果证实其猪源性。结论 所测骨质样本应为猪骨样本。

关键词: 法医遗传学; 骨质样本; 磁珠法; 法医鉴定试剂盒; 肉源种属; 猪源性
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2020)05-0534-04
Identification of Pig Osseous Tissue
CHEN Weizhong1,2, WANG Xin1, ZHANG Jian1, SHI Yunjie1, MA Wenhua2, DING Guangshu2, LU Wenjun3, WANG Gao3, JIANG Yingye3, ZHOU Ruhua1,*
1. Institute of Forensic Science, Suzhou Public Security Bureau, Suzhou 215131, Jiangsu, China
2. Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing 100038, China
3. AGCU ScienTech Incorporation, Wuxi 214174, Jiangsu, China
Abstract

Objective To identify an osseous sample from one case scene for the ascertainment of its species.Methods The bone sample was extracted through the method of magnetic beads, with the collected DNA being amplified via both the forensic identification Kit AGCU Expressmarker22 and the kit for species identification of meat-kind source. Therefore, AGCU swine-oriented identification kit was finally chosen to retest the DNA with real-time PCR of fluorescent quantification.Results The bone sample was detected of no amplified peaks of any locus relating to the AGCU Expressmarker22 amplification kit, yet having been ascertained of pork origin by the kit for species identification of meat-kind source, thus eventually confirmed as pig's through the real-time PCR by AGCU swine-oriented identification kit.Conclusion The bone sample was identified of swine.

Key words: forensic genetics; bone sample; magnetic beads; forensic identification kit; species of meat-kind source; swine-oriented

在一些复杂的案件中, 有些样本并非来源于人类组织样本而是可能源自其他动物物种。这类样本的种属来源鉴定, 也会对案件的侦破起到积极作用。因此, 对于生物组织样本, 当使用法医鉴定试剂盒未能得出结果时, 可以尝试使用肉源种属鉴定试剂盒进行测试。若样本来源于其他动物种属, 就可进一步确定其具体种属, 从而助推案件的侦破。针对常见的动物种属, 肉源种属鉴定试剂盒通过选择保守性较好的线粒体细胞色素b基因为靶基因, 结合毛细管电泳检测平台, 能对多种动物的种属源性进行鉴定, 且其灵敏度与准确度也均较高。

1 材料与方法
1.1 样本

样本为某市公安分局送检的案发现场未知骨质检材（半新鲜样本, 除钙化骨质物外, 还存在一定的骨髓和附骨肌肉组织）。

1.2 主要试剂与设备

Mag MLPE DNA Kit法医物证核酸提取试剂盒（上海英莱盾生物技术有限公司）; AGCU Expressmarker22荧光检测试剂盒、AGCU肉源种属鉴定试剂盒、AGCU猪源性检测试剂盒（无锡中德美联生物技术有限公司）。

TissueLyser Ⅱ 骨骼研磨仪（德国QIAGEN 公司）; NanoDrop ND-2000（赛默飞世尔科技公司）; 3500 xL基因分析仪、9700型PCR仪（均来自美国AB公司）; Mini8 Plus实时荧光定量PCR仪（北京卡尤迪生物科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 核酸提取

取骨质样品, 经敲碎处理后, 取适宜大小的碎块, 置于1.5 mL的EP管中, 加入适量双蒸水, 涡旋振荡清洗, 重复一次, 以去除样本表面污染物。然后再使用TissueLyser Ⅱ 骨骼研磨仪研磨成粉末, 取适量粉末于1.5 mL离心管中, 使用Mag MLPE DNA Kit法医物证核酸提取试剂盒提取DNA, 操作方法参照试剂盒说明书。最后, 采用30 μ L洗脱液溶解, 使用Nanodrop紫外可见分光光度计测其浓度与纯度。

1.3.2 AGCU Expressmarker22荧光检测试剂盒检测

取上述样本DNA 1 μ L, 采用AGCU Expressmarker22 荧光检测试剂盒（含有22个STR基因座）进行检测, 体系为10 μ L, 热循环参数按照试剂盒说明书进行。以9947A和超纯水作为阳、阴性对照。扩增后, 再以3500 xL基因分析仪检测扩增产物, 采用GeneMapperTM ID-X v1.5软件进行数据分析。

1.3.3 肉源种属检测

取1.3.1中样本DNA稀释10倍, 取1 μ L模板, 采用AGCU 肉源种属鉴定试剂盒（含有9个动物Cytb基因成分）进行检测, 体系为10 μ L, 热循环参数按照试剂盒说明书进行, 共24个扩增循环。检测和数据分析同1.3.2。

1.3.4 检测结果验证

使用AGCU猪源性检测试剂盒, 在八连管中加入预混的反应缓冲液19 μ L和1 μ L稀释10倍后样本, 重复3次, 将八连管置于Mini8便携式荧光定量PCR仪中进行热循环扩增, 扩增程序参照试剂盒操作手册, 根据扩增曲线及Ct值判断模板中是否含有猪源性成分。

2 结果与分析
2.1 提取核酸的浓度检测

使用Nanodrop对提取的DNA进行浓度测试, OD260/OD280为1.84, 核酸浓度为49.3 ng/μ L。

2.2 法医DNA分型试剂盒检测

应用AGCU Expressmarker22 荧光检测试剂盒扩增提取样本的DNA并经毛细管电泳后, 再以GeneMapperTM ID-X v1.5软件作分析, STR基因座检出标准为：基因能正确分型, 谱峰清晰, 判型准确, 峰值大于100 RFU。结果显示, 样本图谱中所有基因座均没有大于100 RFU扩增峰。由于所检测试剂盒是用于人类基因组DNA检测的个体识别试剂盒, 具有人特异性, 故推断所检验样本不是人DNA。

2.3 肉源种属检测

应用AGCU肉源种属鉴定试剂盒对提取的DNA样本进行检测, 扩增产物用3500 xL遗传分析仪进行毛细管电泳, 结果如图1。

图1 AGCU肉源种属鉴定试剂盒测试提取样本DNA
Fig.1 Species identification of the DNA tested with AGCU kit of meat-kind source

通过GeneMapperTM ID-X v1.5软件分析电泳结果, Cytb基因检出的标准为：基因能正确分型, 谱峰清晰, 判型准确, 峰值大于100 RFU。结果显示只有猪对应的基因有明显的扩增峰, 且该峰峰值高度达到16 844 RFU, 而其余种属的基因均无对应分型的扩增峰出现, 故判断所鉴定的骨质样本为猪种属样本。

2.4 鉴定结果复测

相比于PCR-毛细管电泳技术, qPCR具有相对较高的灵敏度。在上述检测的基础上, 使用依托于qPCR平台的AGCU猪源性成分检测试剂盒, 对初步明确种属来源的骨质检材做进一步验证测试, 进一步明确该骨质检材的种属来源, 检测结果如图2所示。

图2 AGCU猪源性成分检测试剂盒扩增提取样本DNA结果
Fig.2 Result of the DNA amplified and quantified with AGCU swine-oriented identification kit

通过扩增曲线可以看到, 3次重复的Ct值为24.58、24.75、24.51, 平均值为24.61, 均远低于30, 而阴性对照无扩增曲线, 阳性对照则有明显扩增, 说明样本提取的DNA为猪源性成分, 该复测结果与使用AGCU肉源种属鉴定试剂盒检测的结果一致。故可以判定, 案件现场发现的这份骨质检材样本为猪源性成分。

3 讨论

由于案件现场的复杂性, 经常需要对现场骨骼碎片进行种属鉴定, 以确定其来源, 对确定案件性质有所帮助。种属鉴定的方法很多, 如曾常用的血清学方法[1]、蛋白质分型、组织形态观察[2]、DNA标记鉴定方法等[3]。血清学方法鉴定对检材要求较高, 而特异性又常难以保证; 蛋白质分型虽然也较快捷方便, 设备廉价, 但案件中常遇到的骨骼碎片却可能因焚烧或者掩埋于复杂环境中, 蛋白质变性或降解严重而难以对其分型; 组织形态观察对观察者的经验要求较高, 较为主观, 目前也没有对多种动物全面的比较测量及统计方法, 故至今没有建立起各种属动物组织形态观察鉴定的统一标准[4]。DNA标记鉴定的方法准确灵敏[5], 即便对于案件现场破坏较严重、难以直接观察的骨骼碎片, 也可从中提取DNA进行种属判别。

本次鉴定所用的AGCU肉源种属鉴定试剂盒是根据动物线粒体细胞色素b（Cytb）基因设计。目前在种属鉴定领域, 细胞色素b基因占44%, 12S rRNA基因占11%, 16S rRNA基因占8%[6], 其余还有少数通过D-Loop区或细胞色素氧化酶I（COXI）[7]进行检测。线粒体的细胞色素b（Cytb）位于线粒体内膜磷脂双层中, 是线粒体自身编码的为数不多的功能蛋白质之一[8]。Cytb基因序列全长为1 100~1 200 bp, 不同物种间的序列长度没有明显差异, 但在核苷酸组成上有不同, 种间具有差异性。由于该基因的编码序列区域进化缓慢, 相对保守, 在不同种动物间具有极高的特异性, 而在同一种动物内又具有较强的保守性, 因而适合于作为多种动物种属鉴定的目标基因靶点[9]。设计适合于不同种属动物Cytb保守区域序列的突变位点引物, 将检测细胞色素b基因与基于毛细管平台的多重PCR检测方法结合, 不仅能使检测扩增准确方便, 而且还可同时鉴定多种动物的源性, 极大地提高检测效率。

本次鉴定所用的AGCU肉源种属鉴定试剂盒可以同时鉴定样本中是否含有猪、牛、羊、鸡、鸭、猫、狗、鼠等8种肉源性成分。本次鉴定在检测出猪源性成分后, 又经AGCU猪源性检测试剂盒进行复测以验证结果。AGCU猪源性检测试剂盒基于荧光定量PCR检测技术针对猪源性成分做检测, 虽然其单次实验仅能针对单一源性成分进行检测, 但相比于毛细管平台的鉴定方法, 灵敏度更高, 而且不必取扩增产物进行分析, 又避免了二次污染的风险。使用荧光定量PCR检测的方法不仅能定性地鉴别目标样本中是否含有种属源性成分, 还可对其中源性成分的含量进行初步定量。本次鉴定结果明确了送检的骨质检材的种属来源信息, 排除了人源性样本的可能, 对案件性质的判断提供了重要依据。

基于分子生物学的DNA标记鉴定方法已经广泛地应用于法医学种属鉴定中, 除了针对类似于本案例中的骨骼检材外, 对于各种体液、分泌液、排泄物、各种组织器官及其碎块、毛发、指甲、牙等检材, 也都可通过肉源种属鉴定试剂盒进行鉴定。这种方法应用于种属鉴定不仅适合于法医学, 在食品安全检测中也被广泛应用, 对于食品中的肉类源性鉴定、饲料中的肉类源性成分检测都是一种可靠的选项。

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