引用本文
蔡玉刚, 徐越, 周达江, 邹波, 常靖. 液相色谱-串联质谱检测血、尿中2′-氯地西泮[J].刑事技术, 2020,45(5):515-517
CAI Yugang, XU Yue, ZHOU Dajiang, ZOU Bo, CHANG Jing. Determination of LC-MS/MS into 2′-Diclazepam in Blood or Urine[J]. Forensic Science and Technology,2020,45(5): 515-517  
Doi: 10.16467/j.1008-3650.2020.05.016
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液相色谱-串联质谱检测血、尿中2′-氯地西泮
蔡玉刚1, 徐越2, 周达江3, 邹波4, 常靖4,*
1.泸州市公安局刑事科学技术研究所,四川 泸州 646000
2.惠州市公安司法鉴定中心,广东 惠州 516001
3.成都市公安局刑事科学技术研究所,成都 610000
4.公安部物证鉴定中心毒物检验技术处,北京 100038

* 通讯作者简介：常靖,女,陕西米脂人,硕士,研究员,研究方向为法医毒物检验、法医毒理学。E-mail: changjing73@126.com

第一作者简介：蔡玉刚,男,四川遂宁人,学士,高级工程师,研究方向为理化检验。E-mail: 12721703@qq.com

基金资助: 公安部现场物证溯源技术国家工程实验室开放性课题（2018NELKFKT 13）
摘要

目的 建立血、尿中2′-氯地西泮的高效液相-串联质谱（LC-MS/MS）检验方法。方法 采用液液萃取对血、尿中2′-氯地西泮进行提取,经高效液相-串联质谱检验。结果 在血液和尿液中2′-氯地西泮0.1~100ng/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系,最低检出限为0.01ng/mL,回收率为60.67%~89.03%。结论 通过实验验证该方法真实可靠,且灵敏度高,易于操作,能用于血尿检材中2′-氯地西泮的检验。

关键词: 法医毒物学; 2′-氯地西泮; 血液; 尿液; 液相色谱-串联质谱
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2020)00-0515-03
Determination of LC-MS/MS into 2′-Diclazepam in Blood or Urine
CAI Yugang1, XU Yue2, ZHOU Dajiang3, ZOU Bo4, CHANG Jing4,*
1. Institute of Forensic Science of Luzhou Public Security Bureau, Luzhou 646000, Sichuan, China
2. Forensic Science Center of Huizhou Public Security Bureau, Huizhou 516001, Guangdong, China
3. Institute of Forensic Science of Chengdu Public Security Bureau, Chengdu 610000, China
4. Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing 100038, China
Abstract

Objective To set up one LC-MS/MS method for determination of 2′-diclazepam in blood or urine.Methods The sample of blood or urine was treated through liquid-liquid extraction to isolate the 2′-diclazepam that was afterwards subjected to LC-MS/MS.Results A good linear relationship was present between the peak area and concentration in 0.1~100ng/mL of 2′-diclazepam in blood or urine, with the limit of detection (LOD) being 0.01ng/mL and recoveries among 60.67%~89.03%.Conclusions The method is reliable, facilitating and sensitivity-high, capable of being used for determination of 2′-diclazepam in blood or urine.

Key words: forensic toxicology; 2′-diclazepam; blood; urine; LC-MS/MS

2′ -氯地西泮（Diclazepam, 2′ -chlorodiazepam）, 又称Ro 5-3448, 化学名为7-氯-5-（2-氯苯基）-1, 3-二氢-1-甲基-2H-1, 4-苯并二氮杂卓-2-酮, 分子量319, 分子式C16H12Cl2N2O, 系设计型苯二氮卓类药物, 属于解离性麻醉剂类新精神活性物质, 是苯二氮卓类处方药替代品之一[1], 大剂量使用会产生嗜睡、昏迷、血压降低、呼吸循环抑制。现阶段, 我国尚未将该药物列入管制类目录, 且互联网上易买到, 近年来涉及2′ -氯地西泮的药物依赖、强奸、抢劫案件时有发生。据文献报道[2, 3, 4], 目前主要检验方法有气质联用法（GC-MS）、傅里叶红外光谱法（FT-IR）、液相色谱串联四极杆静电场轨道阱质谱法（LC-QE）和核磁共振NMR。由于2′ -氯地西泮属于设计型药物, 缺少标准品且尚未录入常用的美国国家科学技术研究院（National Institute of Standards and Technology, NIST）质谱库（2017版）中, 易被漏检。因此, 本文对2′ -氯地西泮的LC-MS/MS检验方法进行研究, 以供各位同行参考。

1 实验部分
1.1 材料与设备

1.1.1 仪器与设备

1290-6470型超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪（美国Agilent公司）; AL204-IC分析天平（瑞士Metlle Toledo公司）; Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）; BKA-120B超声波（济南巴克公司）; IKA涡旋振荡仪（德国IKA公司）; XMTD-4000恒温水浴锅（北京永光明医疗仪器有限公司）。

1.1.2 标准与样本

2′ -氯地西泮甲醇溶液（1 mg/mL, sigma-aldrich, 美国）, 甲醇、乙腈（色谱merck, 德国）, 乙酸铵、甲酸（色谱纯sigma-aldrich, 美国）。血液由血站提供, 空白尿液由近期未服用任何药物的健康志愿者提供。

1.2 实验条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent SB C18 Aq （2.1 mm× 50 mm , 1.8 μ m）; 流动相：A相, 0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸胺水溶液; B相, 乙腈。柱温：35 ℃; 流速：0.2 mL/min; 进样量：1 μ L; 梯度洗脱条件：B相初始浓度为20%, 在8 min内流动相B由20%增加到95%并保持2 min, 整个实验过程用时10 min。

1.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）, 正离子扫描; 干燥气温度：325 ℃; 干燥气流速：10 mL/min; 雾化器压力：35 psi; 屏蔽气：氮气, 气体温度400 ℃, 流量12 mL/min; 毛细管电压：Vcap 4000 V。检测方式：多反应监测（MRM）扫描, 定性离子对为319.0/154.0、319.0/227.0, 选择丰度较高的319.0/227.0作为定量离子对。

1.3 样品处理

1.3.1 溶液配制

精密量取1.0 mL 2′ -氯地西泮标准液于10 mL容量瓶中用甲醇混匀并定容至10 mL, 配成0.1 mg/mL 2′ -氯地西泮甲醇储备液, 低温保存。用储备液配制0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 ng/mL 2′ -氯地西泮标准液, 作为标准曲线工作液。用储备液配制0.01 ng/mL 2′ -氯地西泮作为质控工作液。

1.3.2 检材前处理

分别取血液、尿液1.0 mL各3份, 添加2′ -氯地西泮使其浓度分别为0.3、5.0、80.0 ng/mL。加10%氢氧化钠1滴, 调pH到10, 加入少量NaCl, 加乙酸乙酯3 mL、超声萃取10 min、涡旋振荡10 min, 在10 000 r/min下离心10 min, 重复提取两次, 合并有机相过膜, 在60℃水浴浓缩至近干, 加入100 μ L甲醇定容后供检验。

1.3.3 质控及标准曲线的溶液配制

分别取空白血液、尿液1.0 mL各8份, 1份作为空白检材, 1份加入0.1 mL 10.0 pg/mL 2′ -氯地西泮标液作为质控工作液, 7份分别添加0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 ng/mL 2′ -氯地西泮作为标准曲线工作液, 其他操作同1.3.2。

2 结果与讨论
2.1 色谱柱的选择

2′ -氯地西泮的结构与地西泮相似属于弱极性物质, 本文考察了SB C18 Aq、Eclipse Plus C18、Pursuit XRs Si三种色谱柱。实验结果表明, 使用SBC18 Aq柱色谱峰较好, 无拖尾现象。

2.2 流动相的选择

实验考察了乙腈和甲醇对2′ -氯地西泮色谱峰形的影响。结果表明, 两种有机溶剂对2′ -氯地西泮的保留时间无明显差别, 乙腈的峰形较好, 故本文选择乙腈作为有机相。在0.1%甲醇水流动相加入乙酸铵, 2′ -氯地西泮的峰形改善明显, 且响应值也得到了提高。1%甲醇水中加入浓度为5~10 mmol/L的乙酸铵对2′ -氯地西泮的响应和峰形影响不明显, 因此选择对色谱柱损害较小的5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸水为水相。

2.3 提取溶剂的选择

考察乙腈、三氯甲烷和乙酸乙酯对2′ -二氯地西泮的提取效率。实验表明, 乙腈的基质效应较大, 三氯甲烷在处理血液时容易乳化, 回收率偏低, 乙酸乙酯的基质效应较乙腈弱, 回收率较三氯甲烷高, 因此选用乙酸乙酯作为提取剂。

2.4 质谱条件的优化

采用1.2.2的实验条件, 将5 ng/mL 2′ -氯地西泮的标准品溶液, 进行母离子全扫描, 确定分子离子峰为m/z 319, 再将分子离子作为母离子进入二级质谱产生了两个主要子离子碎片m/z 154、227（图1）, 选择两个丰度较高的特征子离子进行测试, 然后以信噪比高、峰形好、干扰小的离子对作为定量离子对。最终选择丰度最高的m/z 227子离子作为定量离子对, 选择m/z 154作为定性离子对。

图1 2′ -氯地西泮质谱图
Fig.1 Mass-spectrogram of 2′ -diclazepam

2.5 线性范围和检出限考察

用配制的0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 ng/mL 2′ -氯地西泮标准液, 分别采用1.2.1色谱条件进行测定。尿液基质的回归方程为：y=2207.45x-159.65, r=0.997 3; 血液基质的回归方程为y=1233.03x-64.70, r=0.999 2。结果表明, 2′ -氯地西泮在浓度0.1 ~100 ng/mL范围内峰面积与浓度具有良好的线性关系; 在尿液基质中, 信噪比S/N=4.1时, 血液基质中, 信噪比S/N=3.8时, 2′ -氯地西泮的最低检出限（LOD）均为0.01 ng/mL。

2.6 回收率及精密度实验

按1.3.2进行加标回收实验, 结果显示, 0.3、5.0、80.0 ng/mL 2′ -氯地西泮在血液中的回收率为60.7%~84.5%, 相对标准偏差（RSD, n=5）为1.0%~1.8%, 在尿液中的回收率为62.2%~89.0%, 相对标准偏差（RSD, n=5）为0.8%~1.7%。可见2′ -氯地西泮极低浓度条件下回收率较低, 但该方法具有较好的准确度、重复性及精密度, 能满足血、尿中2′ -氯地西泮分析的要求。

2.7 基质效应的考察

基质效应[5]（matrix effects, ME）会影响方法的灵敏度、精密度和准确度, 本文考察了血液和尿液, 进行了基质效应评价。利用空白血液和尿液平行处理的方式获得空白基质液, 然后利用空白基质液配备相应浓度的标准曲线工作液, 考察2′ -氯地西泮的基质效应（ME）, 采用公式ME = B /A（ B 为基质匹配标准曲线的斜率, A 为纯溶剂配制标准曲线的斜率） 计算ME。在0.1 ~100 ng/mL浓度下, 在尿液基质曲线下ME为0.97, 在血液基质曲线下ME为0.88, 均呈弱基质效应。为了减小基质效应给定量带来的偏差, 本实验使用配制空白基质液作为工作曲线配备液的方法制作标准曲线。

3 案例应用

2018年4月8日, 某市受害人舒某（女）被犯罪嫌疑人麻醉后强奸。案发后约107 h, 在家人的陪同下到公安机关报案, 随后公安机关在受害人拒绝抽血的情况下, 取得其两次全尿送检, 结果在尿液中检出了2′ -氯地西泮。

4 结论

本文建立的血、尿中2′ -氯地西泮的高效液相-串联质谱分析方法, 采用了空白基质液作为工作曲线, 消除了基质的影响, 提高了定量的准确性。该方法重现性好, 灵敏度高, 易于操作, 适用于实际工作中2′ -氯地西泮的检测。

参考文献
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