引用本文
贾霄, 曹丹, 王文雯, 吴雅兰. FTA卡采集和常温保存肋软骨组织的方法[J].刑事技术, 2020,45(5):503-506
JIA Xiao, CAO Dan, WANG Wenwen, WU Yalan. Collection and Preservation of Costicartilage Tissue with FTA Card at Room Temperature[J]. Forensic Science and Technology,2020,45(5): 503-506  
Doi: 10.16467/j.1008-3650.2020.05.013
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FTA卡采集和常温保存肋软骨组织的方法
贾霄, 曹丹, 王文雯, 吴雅兰
清远市公安局刑事警察支队,广东 清远 511500

第一作者简介：贾霄,男,甘肃庆阳人,学士,副主任法医师,研究方向为法医遗传学。E-mail: qyjxiao@163.com

摘要

目的 建立一种快捷有效的肋软骨组织采集和保存方法。方法 用FTA卡采集尸体肋软骨匀浆,使肋软骨组织吸附在FTA卡上,采用直扩法检验STR分型。肋软骨FTA卡采用真空物证袋密封,常温下保存两年,采用直扩法检验STR分型。结果 肋软骨FTA卡采用直扩法检验可得到完整的STR分型图谱,158份检材检出率为93.0%。有效检出分型的肋软骨组织在FTA卡上常温保存两年,STR分型检出率为100%。结论 本方法既可通过直扩来替代传统肋软骨组织提取DNA的繁琐步骤,又可解决肋软骨在常温下难以保存的难题。

关键词: 法医物证学; 肋软骨; FTA卡; DNA提取; STR分型
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2020)05-0503-04
Collection and Preservation of Costicartilage Tissue with FTA Card at Room Temperature
JIA Xiao, CAO Dan, WANG Wenwen, WU Yalan
Criminal Police Detachment of Qingyuan Public Security Bureau, Qingyuan 511500, Guangdong, China
Abstract

Objective To establish a fast and effective method using FTA card to both collect and preserve costicartilage tissue.Methods FTA card was adopted to collect the homogenized costicartilage suspension so that the costicartilage tissue was adsorbed onto it. From the FTA cards with which costicartilage tissue was just collected or the collection finished and successively sealed into vacuum evidential material bags for two years at room temperature, STR typing was respectively carried out through direct amplification.Results The costicartilage-carrying FTA cards provided complete STR genotyping profiles with direct amplification, revealing a detection rate of 93.0% from 158 samples. Effective detection was also obtained of the costicartilage tissue preserved on the FTA cards (the stored 147 pieces) for two years at room temperature, exhibiting 100% detection rate of STR genotyping without allelic dropout.Conclusions This method is able to leave the tedious DNA extraction from costicartilage material to the direct amplification, thereby having surmounted the problem that costicartilage is difficult to preserve at room temperature.

Key words: forensic biology; costicartilage; FTA card; DNA extraction; STR typing

对于未知名尸体常需要提取并检测DNA以确定尸体身源, 肋软骨较软组织不易腐败, 较骨骼、牙齿易提取到模板DNA, 在腐败尸体检验中是较好的检材[1]。但这类检材常温下易腐败, 使DNA降解, 往往只能低温保存、冷链运输, 造成保存成本高, 运输难度大; 并且由于微生物的作用, 肋软骨组织在送检存放过程中易产生恶臭气体和有害物质, 危害人体健康。目前肋软骨DNA的提取可采用磁珠法、硅珠（膜）法、有机法和Chelex-100法等方法[2, 3, 4]。也有报道采用直接扩增法检验新鲜肋软骨DNA, 该方法的优势在于可省去DNA提取环节和前期消化过程[5, 6]。目前, 国内外常采用低温冷冻的方法保存肋软骨, 但其常温保存鲜有研究报道。

FTA（Flinders Technology Associates）卡是英国Whatman公司专利产品, 为室温下采集、运输和储存检材提供了稳妥、安全、可靠的方法。有研究表明, FTA卡法可作为一种通用、快速、简便的DNA模板制备方法, FTA卡中含有特殊的化学物质, 当检材吸附在卡上时, 细胞膜和细胞器被裂解, 蛋白质变性, 释放出的核酸被捕获在FTA卡纤维上, 从而免受核酸酶、氧化剂和紫外线损伤[7]。FTA卡可以快速地使有机体（包括血液中的各种病原体）失活, 并抑制细菌和其它微生物的生长, 基因组DNA可在FTA卡上室温条件下储存17年以上, 而不会降低扩增效率[8]。另外, 美国公司研发的FTA基因保藏系统在常温保存基因方面也有很好的效果, 可以长时间地保存基因样品, 而无须考虑在远距离运输基因样品时环境温度等条件对基因样品的影响[9]。

本文建立一种将肋软骨组织制备成匀浆保存在FTA卡上的方法。通过FTA卡打孔直扩法实现肋软骨快速DNA检验, 取代了传统DNA提取的繁琐步骤; 通过真空物证袋密封, 可实现室温长期保存, 解决了常温下难以保存肋软骨的难题。

1 材料与方法
1.1 样本及主要试剂

本实验室日常检案积累的肋软骨检材158份, 其中新鲜尸体肋软骨130份, 轻度腐败尸体肋软骨17份, 高度腐败尸体肋软骨11份。Identifiler Plus扩增试剂盒（Thermo Fisher公司, 美国）; FTA卡（Whatman公司, 英国）等。

1.2 肋软骨FTA卡制备和DNA提取

采用无外源性DNA一次性组织匀浆锉（本实验室自主研发产品）, 其中包含初处理区和砂面研磨区。将肋软骨组织制备成匀浆, 用FTA卡进行采集, 具体步骤为：1）用手术刀在初处理区上切取肋软骨1~2 cm, 剔除周围结缔组织、腐败组织; 2）用组织钳夹持肋软骨, 在砂面研磨区上小范围擦拭研磨5~6次, 滴加适量超纯水（1~2滴）, 混匀, 制成肋软骨组织匀浆; 3）用海绵签将组织匀浆均匀涂布于FTA卡标示的圆环范围内, 肋软骨组织匀浆被吸附于FTA卡上; 4）将制备好的肋软骨FTA卡室温干燥1 h; 5）用2 mm打孔器在FTA卡上打孔, 取1片用于直扩。对照组模板采用Chelex-100法提取后扩增。

1.3 肋软骨FTA卡保存和DNA提取

将有效检出的肋软骨FTA卡（147份）用真空物证袋密封, 编号, 室温下保存两年。用2 mm打孔器在FTA卡上打孔, 取1片用于直扩。

1.4 PCR扩增

采用AmpFlSTR® Identifiler® Plus试剂盒进行PCR扩增, 反应总体积25 μ L。热循环条件按试剂盒推荐设定参数。

1.5 电泳检测

扩增产物经3500 xL遗传分析仪检测, 电泳参数按说明书规定进行, 以GeneMapper ID-X软件进行STR分型分析。

2 结果与讨论
2.1 结果

本研究应用的158份肋软骨组织是日常办案中通过Chelex-100法提取, 均得到了完整的STR分型后, 才分别制备FTA卡, 待阴干后直接扩增, 有147份肋软骨FTA卡得到了完整的STR分型结果, STR检出率为93.0%（147/158）。图1为某案件A201609097008号检材采用肋软骨FTA卡直接扩增得到的STR图谱, 图2为A201609097008号检材采用Chelex-100法提取后扩增得到的STR图谱。同一检材用两种方法检测分型结果一致, 未见等位基因丢失现象。未检出有效STR分型的11份肋软骨FTA卡属于高度腐败尸体肋软骨检材。

图1 肋软骨FTA卡直接扩增得到的STR分型
Fig.1 STR genotyping by direct PCR amplification onto costicartilage-carrying FTA card

图2 对照组肋软骨的STR分型
Fig.2 STR genotyping of the controlling costicartilage

上述有效检出的肋软骨FTA卡（147份）在常温下保存两年, 打孔直接扩增检测, STR检出率为100%, 未见等位基因丢失现象。总体而言, 刚制成的肋软骨FTA卡（147份）直接扩增所得图谱在PCR产物峰高波动范围、同一基因座上杂合间峰值比、同一荧光染料不同基因座间的均衡性等指标均好于保存两年后肋软骨FTA卡直接扩增结果。例如：图3为A201609097008号检材采用肋软骨FTA卡保存两年后直接扩增得到的STR图谱, 与同一检材刚制成的肋软骨FTA卡图谱（图1）相比, 所得图谱指标稍差。采用PowerPlex® 21 System试剂盒进行复核性检验, 结果无误。

图3 保存两年肋软骨FTA卡直接扩增得到的STR分型
Fig.3 STR genotyping by direct PCR amplification onto costicartilage-carrying FTA card that was stored for two years

2.2 讨论

肋软骨是尸体检验中的常见检材, 从肋软骨组织中提取DNA检验STR分型是对未知名尸体进行尸源鉴定的重要手段。本方法采用FTA卡常温干燥保存肋软骨组织, 相对优于其他的保存方式。目前, 肋软骨常采用冷冻保存, 这种方法保存检材难度大, 既浪费电力又占用冰箱, 如保存不当易造成检材腐败, 导致DNA降解。如将肋软骨切薄片后保存, 则需要对该薄片进行干燥, 此方法对检材保存环境要求较高, 不适用于南方湿度大、气温高的环境。赵凯等[10]采用弹夹式尸体肋软骨包装盒保存肋软骨组织, 可以吸附腐臭气味, 但亦不能实现常温保存。相对于传统送检方式, 本方法可常温送检, 安全方便。特别是肋软骨FTA卡的制备不受时间、地域的限制, 可以在案件现场、尸体解剖室、实验室等区域制作完成, 无需将肋软骨送到DNA实验室, 送检过程中避免了有害病原菌的传播[8], 从而保证了DNA实验室的洁净卫生, 可以有效避免检材相互污染, 还可以减少对检验人员的危害。

DNA检验人员在收到肋软骨FTA卡后, 打孔直接扩增即可, 省去了繁琐的消化过程, 大大节省了提取时间。在实验过程中, 可通过打孔器孔径的大小和打孔纸片的数目来控制扩增的DNA模板量。同时, 采用FTA卡保存肋软骨组织不影响DNA二次纯化, 对于杂质多的检材, 可通过水洗法快速纯化, 亦可采用其他方法如硅珠法对肋软骨DNA进行二次纯化和提取, 以获得更高质量的模板DNA。FTA卡上的肋软骨组织常温保存两年检出率能达到100%, 未见等位基因丢失现象, 证实了FTA卡保存肋软骨DNA的有效性, 已满足日常物证送检与保存的需求。当然, 由于DNA在保存过程中会存在降解, 上述结果呈现刚制成的肋软骨FTA卡直接扩增图谱在PCR产物峰高波动范围、同一基因座上杂合间峰值比、同一荧光染料不同基因座间的均衡性等好于两年后的肋软骨FTA卡直扩结果的现象。本研究中的158份肋软骨组织通过常规方法（Chelex-100法）提取, 均得到了完整的STR分型, 将其全部转移到FTA卡上, 直接扩增, 有147份肋软骨FTA卡得到了完整的STR分型, 有11份FTA卡未检出有效的STR分型。这11份属于高度腐败尸体肋软骨, 采用常规的Chelex-100法提取需要加大检材的量, 否则也不能检出有效STR分型。高度腐败尸体肋软骨组织DNA含量低, 采用本方法不适用于直扩。

采用FTA卡保存肋软骨组织, 可以克服低温保存的局限性, 为常温下远距离运输提供了条件, 提升了保存的有效性和运输的安全性。截至目前, 肋软骨组织可在FTA卡上保存两年, 至于保存时间更长的肋软骨组织是否适用, 还有待进一步实验验证。

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