Yfiler^® Plus试剂盒内的阳性对照物007（2 ng/μ L）。

ProFlex^TM 3× 32-well PCR扩增仪, 3500xL遗传分析仪和GlobalFiler^TM PCR复合扩增试剂盒, 均为美国ThermoFisher Scientific产品; Allegra X-30离心机（Beckman Coulter, 美国）。

1.3.1 复合扩增

按照GlobalFiler^TM PCR复合扩增试剂盒说明书进行PCR扩增检验。10 μ L扩增体系配比如下：反应缓冲液3.0 μ L, 引物混合物1.0 μ L, 007（2 ng/μ L） 4.5 μ L, 水1.5 μ L。配制12个扩增体系。PCR扩增循环数设置为30。

1.3.2 电泳检测

用3500xL遗传分析仪进行毛细管电泳, 电泳后使用GeneMapper^® ID-X 1.4软件进行数据分析。

实验组：每次电泳时, 选择1个毛细管泳道对007扩增产物进行电泳, 1个毛细管泳道对等位基因Ladder进行电泳, 其余22个毛细管泳道对空白对照进行电泳。分别选择第1、3、5、……23号毛细管泳道（共12个）对007扩增产物进行电泳, 12个泳道内的007分别来自12个扩增体系, 第1~24号毛细管泳道与96孔板的对应关系见表1^[6]。007扩增产物电泳液组成：9 μ L甲酰胺+0.2 μ L内标+1 μ L 007扩增产物。空白对照电泳液组成：9 μ L甲酰胺+0.2 μ L内标。内标为GeneScan^TM 600 LIZ^TM Dye Size Standard。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 24道毛细管与96孔板对应关系 Table 1 The capillary-to-plate matching (24-capillary to 96-well plate) of the default injection order 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cap.1 Cap.2 Cap.3 Cap.1 Cap.2 Cap.3 Cap.1 Cap.2 Cap.3 Cap.1 Cap.2 Cap.3 B Cap.4 Cap.5 Cap.6 Cap.4 Cap.5 Cap.6 Cap.4 Cap.5 Cap.6 Cap.4 Cap.5 Cap.6 C Cap.7 Cap.8 Cap.9 Cap.7 Cap.8 Cap.9 Cap.7 Cap.8 Cap.9 Cap.7 Cap.8 Cap.9 D Cap.10 Cap.11 Cap.12 Cap.10 Cap.11 Cap.12 Cap.10 Cap.11 Cap.12 Cap.10 Cap.11 Cap.12 E Cap.13 Cap.14 Cap.15 Cap.13 Cap.14 Cap.15 Cap.13 Cap.14 Cap.15 Cap.13 Cap.14 Cap.15 F Cap.16 Cap.17 Cap.18 Cap.16 Cap.17 Cap.18 Cap.16 Cap.17 Cap.18 Cap.16 Cap.17 Cap.18 G Cap.19 Cap.20 Cap.21 Cap.19 Cap.20 Cap.21 Cap.19 Cap.20 Cap.21 Cap.19 Cap.20 Cap.21 H Cap.22 Cap.23 Cap.24 Cap.22 Cap.23 Cap.24 Cap.22 Cap.23 Cap.24 Cap.22 Cap.23 Cap.24 注：Cap.1~24表示第1至24号毛细管。

表1 24道毛细管与96孔板对应关系 Table 1 The capillary-to-plate matching (24-capillary to 96-well plate) of the default injection order

对照组：选择1个毛细管泳道对等位基因Ladder进行电泳, 其余23个毛细管泳道全部对空白对照进行电泳。空白对照电泳液组成：9 μ L甲酰胺+0.2 μ L内标。

实验组12个007样本分型图谱的最高峰值均在30 000 RFU以上, 其荧光信号在相邻毛细管中均产生了串扰信号（见表2）。在去除源信号的对照组实验中, 所有空白对照均未显现相关峰图。电泳分析时, 超过设备荧光饱和阈值的样本称之为过载样本。本实验室的3500xL遗传分析仪的荧光饱和阈值范围为29 000~30 000 RFU（每台设备的数值会有不同, 各实验室需自行测定）, 此次实验中所有007样本的最高峰值均超过仪器的饱和阈值, 全为过载样本, 其强烈的荧光信号使得相邻的空白样本毛细管也检测出弱荧光信号, 产生低峰值图谱, 所有串扰峰的峰高均在源信号峰高的1%以下（如图1）。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 泳道间的信号串扰举例 Table 2 The exampling signal crosstalks occurring in the involved capillary lanes 样本位置 分型图谱中的最高峰值（RFU） 源信号 串扰信号 源信号 串扰信号 A1（1） A2（2） 32040 134 A6（3） A5（2）, B4（4） 32017 110 B8（5） B7（4）, B9（6） 32191 188 C10（7） B12（6）, C11（8） 32191 128 C3（9） C2（8）, D1（10） 32083 155 D5（11） D4（10）, D6（12） 32236 167 E7（13） D9（12）, E8（14） 32029 143 E12（15） E11（14）, F10（16） 32010 140 F2（17） F1（16）, F3（18） 32316 132 G4（19） F6（18）, G5（20） 30110 125 G9（21） G8（20）, H7（22） 32171 169 H11（23） H10（22）, H12（24） 32216 212 注：样本位置包含样本在96孔板上的位置及对应的毛细管位置, 如“ A6（3）” 表示样本在96孔板上的位置为A6, 对应第3号毛细管。

表2 泳道间的信号串扰举例 Table 2 The exampling signal crosstalks occurring in the involved capillary lanes

图1

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	图1 第23号毛细管的荧光信号（H11）在第22号毛细管（H10）和第24号毛细管（H12）产生的串扰信号 Fig.1 Signal crosstalk occurring between capillary 23 and capillary 22/24

在实际办案中, 来源于不同案件的样本间信号串扰现象如图2所示。C9号样本（对应第9号毛细管）的最高峰值在32 000 RFU以上, 为过载样本。C8号样本（对应第8号毛细管）的峰值较低, 最大峰高为137 RFU, 含有OL峰, 峰图的整体分布与C9号样本相似, 初步判断可能是C9号过载样本的串扰信号, 随后我们将C8号电泳液吸出、重新单独电泳, 所有信号峰均消失, 确认C8的弱信号确为C9号样本的串扰信号。

图2

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	图2 来源于不同案件的两个样本间的信号串扰（C9为源信号, C8为串扰信号） Fig.2 Signal crosstalk between two samples from different cases (C9: source signal, C8: crosstalk signal)

本研究显示, 在3500xL遗传分析仪毛细管电泳过程中, 过载样本在相邻毛细管中可能产生串扰信号, 串扰信号的峰值较低, 一般在源信号的1%以下。曾在案件检验中观察到的几个信号串扰现象也均是高浓度样本的信号串扰超过空白样本的背景噪音所致。串扰信号中, 每个基因座上串扰峰的位置与源信号峰相似, 但有时会出现与源信号峰相差几个碱基的情况（多或少均有可能）, 如图1中第22号毛细管内的串扰信号在D16S539基因座上的OL峰、在CSF1PO基因座上的10.3/11.3分型等。

串扰信号是由源信号产生的伪峰, 在去除源信号以后, 用串扰信号所在毛细管的样本再次单独电泳, 则串扰信号消失。因此, 判断一个弱信号是否为串扰信号, 首先应观察其相邻毛细管是否有分型相似的高浓度样本, 如果有, 则该弱信号就可能为串扰信号, 然后应通过弱信号样本的单独电泳进行验证：若信号峰消失, 则可以判定为串扰信号而排除; 若信号峰不消失, 则弱信号峰应为样本自身的真实分型, 可用于进一步的分析。

多道毛细管电泳分析方法中, 在以下三种情况下可能检测到串扰信号^[5]：1）设备硬件故障：如毛细管、激光发射端和荧光接收端等的故障导致荧光光路出现异常; 2）空间校准失败：空间校准后, 每根毛细管对应的CCD相机上的荧光接收区域是固定的, 震动、移机等可能会造成毛细管上激光接收窗口的移动, 从而导致荧光光路与CCD相机上荧光接收区域的错位, 产生串扰; 3）上样量过载：毛细管中DNA浓度过高时, 其强烈的荧光信号可能会在相邻毛细管中产生高于噪音信号水平的串扰信号。在对毛细管的串扰研究中, 会发现有些样本的整体峰高在10 000~20 000 RFU之间, 虽然未超过设备的荧光饱和阈值, 但也可能检出串扰信号, 通过更换毛细管阵列或重新进行空间校准可能会有所改善。总之, 要降低毛细管间信号串扰的影响需要定期对设备进行维护、及时进行空间校准并合理控制电泳上样量。

对DNA模板定量能够更加规范检验程序^[7]。但当前我国许多法庭科学DNA实验室在进行STR分型检验时未在PCR扩增前进行DNA模板定量, 扩增体系中加入的DNA模板量主要依赖于对检材的评估及相关经验总结, 电泳时容易出现上样浓度过高的情况, 因此实际DNA案件中检出的串扰信号多属于由高浓度样本引起的串扰, 检验人员需特别警惕此类串扰的发生。当然, 高浓度样本产生的串扰信号的强弱、能否被检测出来还与遗传分析仪的硬件状态、毛细管阵列的新旧程度、相邻毛细管的噪音信号水平等有关。

本文一方面通过实验验证了毛细管间信号串扰的存在, 另一方面为串扰信号的判断提供了方法参考。案件中检出的相邻毛细管之间的信号串扰一般是高浓度样本在相邻空白样本或低浓度样本中产生的弱信号干扰, 最大危害是两个案件之间的信号串扰造成假的串并案或者一个案件中分别来源于受害人和嫌疑人的不同样本之间的信号串扰造成侦查方向的误判, 尤其当处理重大案件时, 由于时间紧、任务重、不肯放过任何细节, 此时一旦发生串扰又没有被意识到时, 就可能给检验带来困扰, 严重的还可能会影响案件的走向。为减少可能因串扰造成的危害, 建议：1）人员样本与物证检材分开检验, 常量与微量物证也严格区分检验; 2）PCR扩增时, 可以考虑引入DNA模板的定量分析, 以规范扩增和电泳程序; 3）在分析低峰值图谱时应首先辨别其是否为串扰信号图谱; 4）各实验室可以根据空白和阴性扩增产物等的电泳结果, 设置合适的分析阈值, 以降低背景信号给数据分析带来的干扰。