引用本文
蒋硕, 李洋, 杨丹, 王坚, 郑吉龙, 何光龙. 利用microRNA-499诊断急性心肌梗死的法医学研究[J].刑事技术, 2020,45(5):454-457
JIANG Shuo, LI Yang, YANG Dan, WANG Jian, ZHENG Jilong, HE Guanglong. Forensic Diagnosis into Acute Myocardial Infarction with miR-499[J]. Forensic Science and Technology,2020,45(5): 454-457  
Doi: 10.16467/j.1008-3650.2020.05.003
Permissions
Copyright©2020, 《刑事技术》编辑部
《刑事技术》编辑部
利用microRNA-499诊断急性心肌梗死的法医学研究
蒋硕1, 李洋2, 杨丹3, 王坚2, 郑吉龙1, 何光龙2,*
1.中国刑事警察学院,沈阳 110035
2.公安部物证鉴定中心,北京 100038
3.哈尔滨医科大学,哈尔滨 150081

* 通讯作者简介：何光龙,男,福建平潭人,硕士,副主任法医师,研究方向为弥漫性轴索损伤、心源性猝死、法医病理损伤、命案现场分析。E-mail: guanglong_he@163.com

第一作者简介：蒋硕,女,北京人,硕士在读,研究方向为心源性猝死病理诊断。E-mail: lucinda5531@163.com

基金资助: “十三五”国家重点研发计划项目（2017YFC0803502）; 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（2016JB041）
摘要

目的 评价miR-499诊断急性心肌梗死的法医学应用价值。方法 利用实时定量PCR技术,研究miR-499诊断急性心肌梗死的敏感性、死后稳定性及鉴别不同死因的能力。首先,在急性心肌梗死发生后不同时间,包括心梗即刻、心梗0.25、0.5、1、2、3、6、12h以及心梗7d,采用real-time PCR技术检测心血血浆中miR-499表达变化;其次,心梗1h死亡和断颈死亡后,分别在死亡即刻及3、6、12、24h采集心血检测miR-499的相对表达量;最后,将大鼠分为断颈死亡、窒息死亡、麻醉过量死亡以及心梗1h死亡组,采用实时荧光定量PCR方法检测miR-499的表达量。结果 心梗1h,miR-499的相对表达倍数达到峰值,是心梗即刻的（64.90±9.26）倍,并于心梗7d逐渐回落至与心梗即刻持平;不同死亡时间中,心梗1h死后miR-499的相对表达倍数及变化幅度均大于断颈死亡组,且在死后3h心梗组miR-499的相对表达倍数是断颈死亡组的3.01倍;在不同死亡原因中,心梗1h的△CT值高于其他死因,且心梗1h与麻醉死亡及窒息死亡的△CT值存在明显差异（ P<0.01）。结论 miR-499用于急性心肌梗死的法医学诊断存在巨大潜力。

关键词: 法医病理学; miR-499; 急性心肌梗死; 生物学指标; 死亡原因
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2020)05-0454-04
Forensic Diagnosis into Acute Myocardial Infarction with miR-499
JIANG Shuo1, LI Yang2, YANG Dan3, WANG Jian2, ZHENG Jilong1, HE Guanglong2,*
1. Criminal Investigation Police University of China, Shenyang 110035, China
2. Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing 100038, China
3. Harbin Medical University, Harbin 150081, China
Abstract

Objective To evaluate the forensic value of miR(microRNA)-499 to diagnose acute myocardial infarction.Methods Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) was conducted to explore the diagnostic sensitivity and postmortem stability of miR-499 in acute myocardial infarction and the discriminability of different causes of death. With the RT-qPCR to detect the miR-499 at different infarction interval, i.e., the moments of both the instantaneous and post-myocardial infarction at, 15min, 30 min, 60 min and 2, 3, 6, 12 hours and 7 days, the experimental rats were taken of their heart blood to get known of the miR-499 expressions. Similarly, the rats, died from either the acute myocardial infarction lasting for 1 hour or broken neck, had their heart blood also taken at different postmortem interval (the moment of immediate death and after hours of 3, 6, 12, 24) to detect the miR-499 expressions. Finally, the experimental rats were divided into 4 groups, respectively killed with suffering for 1 hour myocardial infarction, neck breaking, suffocating and anesthetizing, having their miR-499 expressions detected through RT-qPCR.Results The miR-499 got peaked of relative expression multiplication at 1 hour myocardial infarction, showing 64.90±9.29 times of that at the immediate myocardial infarction which to be gradually fallen back from the peak until after 7 days. In different postmortem intervals, miR-499 was obviously greater at the death from 1 hour myocardial infarction than that from the neck breaking group in relation to its variation range and the relative expression multiplication. For 3 hours after death, miR-499 was 3.01 times higher of the myocardial infarction group than that of the broken neck group. In different causes of death, △CT was higher of 1 hour myocardial infarction than that of the other death cause, demonstrating significant difference among the 1 hour myocardial infarction, suffocation and anesthesia ( P<0.01).Conclusion The miR-499 expression is of great potential in forensic diagnosis for acute myocardial infarction.

Key words: forensic pathology; miR(microRNA)-499; acute myocardial infarction; biological indicator; death cause

急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）是心源性猝死的重要病因, 其发病急骤, 病理变化时间短, 常规组织病理学方法有时难以准确检验, 因此准确诊断AMI仍是法医病理学领域的重点及难点[1]。临床研究表明, 微小RNA（microRNA, miRNA）对心肌细胞功能具有重要的调节作用, 与心血管疾病的发生发展密切相关[2], 有望成为诊断AMI的生物学标志物。其中, miR-499是肌球蛋白基因编码的miRNA家族成员之一, 在心肌梗死的发生过程中具有重要的调节作用[3]。相较于其他心肌特异性miRNA, miR-499不仅与AMI的相关性最为显著, 还具有特异性强、敏感性高的特点[4, 5]; 与其他传统生物学标志物相比, miR-499出现于AMI患者血浆中的时间更早[6]; miR-499诊断AMI的准确性也高于cTnT, 并且不会受到肾功能减退的影响[7, 8], 因此miR-499有望成为临床早期诊断AMI的新指标[9]。目前在法医学领域, miRNA主要被研究用于体液鉴别[10]。本研究期望通过检测不同心梗时间以及心梗后不同死亡时间miR-499的含量以及不同死亡原因miR-499的表达差异, 评价其在AMI中的法医学应用价值。

1 材料与方法
1.1 实验动物分组

选取144只SD大鼠, 13~16周龄, 体质量230~270 g, 适应性饲养3 d后, 分为不同心梗时间组、不同死亡时间组和不同死因组。

不同心梗时间组:AMI大鼠共72只, 分为9组, 每组8只。具体分组：心梗即刻、0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h、6 h、12 h、7d。心梗即刻为结扎冠状动脉后立即取血; 其余大鼠均在到达相应心梗时间后麻醉状态下开胸, 提取心血。

不同死亡时间组：心梗1 h后, 断颈处死大鼠40只。共分5个死亡时间（postmortem interval, PMI）组, 每组8只大鼠。具体为死后即刻与3、6、12、24 h。

不同死因组:急性心梗1h死亡、断颈死亡、窒息死亡、麻醉中毒死亡4组, 每组8只大鼠。

1.2 动物模型制作

心梗模型的建立:大鼠行异氟烷吸入麻醉后, 仰卧固定于操作台, 行气管插管, 连接小动物呼吸机给予正压通气, 吸呼比1∶ 1、通气频率60次/min, 潮气量3 mL。左侧开胸, 经胸骨左缘第4~5肋间, 钝性分离肌肉, 充分暴露心脏, 剪开心包, 在左心耳的垂直轴与肺动脉延长线所围成的区域内, 结扎冠状动脉, 见心尖部苍白, 心电图出现ST段抬高即结扎成功。逐层缝合胸壁, 待自主呼吸恢复后拔出通气导管。

不同死因组的处死方式:断颈死亡采用直接断髓法致死; 机械性窒息死亡采用结扎气管致死; 麻醉死亡采用将大鼠置于异氟烷浓度为5%的气体中致其麻醉过量死亡。

1.3 样本的保存

血液样本全部放置于抗凝管中, 静置30 min后, 3000 r/min离心15 min, 分离血浆到1.5 mL离心管中, 放置于-80 ℃冰箱内保存。

1.4 检测血浆中miR-499的含量

血浆总RNA提取：使用miReasy Serum/Plasma kit（美国Qiagen公司）提取血浆中的总RNA。使用Nanodrop ND-1000测定提取RNA的浓度。

逆转录：引物miR-499逆转录引物序列为cgcgcTTAAGACTTGCAGTGATGTTT, TaKaRa产品货号为：DHM0398; U6的逆转录引物序列为TAGCATGGCCCCTGCGCAA, TaKaRa产品货号为：D356-03。按照Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit（TaKaRa公司）的要求配制成10 μ L液体, 逆转录反应条件为37 ℃ 1 h, 85 ℃ 5 min, 4 ℃ 保存, 使用前加入90 μ L ddH2O稀释成100 μ L液体。

RT-PCR：按照Mir -XTM miRNA qRT-PCR TB Green® Kit（TaKaRa公司）操作步骤构建25 μ L反应体系, 以U6作为内参, PCR扩增条件为95℃预变性5 min, 95 ℃ 10 s, 60 ℃ 30 s, 40个循环。

1.5 分析与统计方法

采用2-∆ ∆ CT方法[11], 根据公式1, 计算miR-499的相对表达倍数。采用∆ CT值[11]（CTmiRNA-499-CT内参U6）计算不同死因miR-499相对表达量。采用SPSS 22.2统计软件对实验数据进行统计学分析。计量资料用平均数± 标准误（mean± s.e.m）表示, 使用one-way ANOVA进行组间比较分析, 采用Kruskal-Wallis H检验对多个独立样本进行差异性比较, 使用student t 检验进行非配对样本比较, P< 0.05认为具有统计学意义。

$2^{-\Delta \Delta CT}=2^{-(CT_{实验组基因}-CT_{内参基因})-(CT_{对照组基因}-CT_{内参基因})}$ （1）

2 结果
2.1 不同心梗时间miR-499的相对表达倍数

以心梗即刻作为对照组, 计算不同心梗时间相对于心梗即刻的miR-499相对表达倍数。如图1a所示, 在心梗0.25 h, miR-499的相对表达倍数稍有上升, 随后于心梗0.5 h稍下降; 心梗1 h, miR-499的相对表达倍数达到（64.90± 9.26）倍, 心梗1 h到2 h, 下降速度较快, 随后miRNA-499含量逐步平稳, 直至心梗后12 h, 基本与心梗即刻持平。

图1 结果图（a：不同心梗时间miR-499的相对表达倍数; b：心梗后不同死亡时间miR-499的相对表达倍数; c：不同死亡原因的△ CT值）
Fig.1 Results (Relative expression multiplication of miR-499 at a: different myocardial infarction durations or b: different postmortem interval after myocardial infarction; c: the value of △ CT of different cause of death)

2.2 心梗后不同死亡时间miR-499的相对表达倍数

心梗1 h组死后miR-499上升时间早于对照组, 在死后3 h出现峰值, 随后下降, 在死亡12 h心血血浆miR-499达到最低; 但对照组的miR-499表达量在死后缓慢上升之后逐步下降, 表达量随死亡时间的变化趋势相对平稳。通过比较, 心梗1 h组miR-499表达量随死亡时间延长变化幅度较大, 但其表达量总体上高于对照组, 死后3 h心梗组miR-499的相对表达倍数是对照组的3.01倍, 此时表达差异最明显（图1b）。

2.3 不同死亡原因miR-499的相对表达数

-△ CT表示引入内参基因校正后, 初始模板的荧光信号到达设定荧光阈值时所经历的循环数, 故-△ CT越小, 循环数越少, 初始模板含量越多, 即-△ CT值与初始模板成反比, 因此△ CT可以反映目的miRNAs的表达量。为了更加直观地反映不同死因的miR-499表达量, 本实验选取△ CT进行计算。U6为血液检测miRNA的经典内参基因[12], 本实验中不同组别的U6表达量不存在组间差异（表1）, 能够较为准确地反映miRNA的相对表达量。心梗1 h的△ CT值明显高于麻醉及窒息死亡, 麻醉死亡的△ CT最低, 经组间比较分析发现, 心梗1 h与窒息死亡和麻醉死亡存在显著差异（如图1c, P< 0.05）。

表1 不同死亡原因的U6表达量（mean± s.e.m） Table 1 U6 expressed from different cause of death (mean± s.e.m)
3 讨论

死后诊断AMI仍然是法医学实践中的难点, 而miRNA与心肌梗死、心律失常、心肌病以及血管增生等多种疾病的早期病理生理密切相关。本研究发现, 急性心梗极早期, miR-499随时间的延长呈现先升高后降低的趋势; 此外死亡时间对心梗引起的miR-499升高影响不大; 同时心梗1 h死亡组心血血浆中miR-499含量高于窒息、麻醉中毒以及断颈死亡组, 因此miR-499具有初步鉴别死亡原因的潜力。

有研究证实, miR-499在AMI的过程中具有重要的调节作用[3]。在心肌发生缺氧性损伤时, miR-499表达增加, 可以减少因缺氧所引起的心肌细胞凋亡[13]。本研究结果显示, 大鼠心肌梗死后, 血浆中miR-499的相对表达倍数明显升高, 且在心梗后1 h达到峰值, 随后逐渐降低, 直至心梗7 d恢复正常。AMI早期, 心肌细胞缺血坏死, 细胞完整性被破坏, 高表达的miRNA会释放入血, 导致心肌中相应的miRNA含量降低, 而血浆中miRNA含量升高[14, 15], 随着心梗时间的延长, 缺血处组织逐渐修复, 漏入血浆中的miRNA逐步减少, 导致血浆中miR-499呈现先升高后降低的现象。法医学实践中, 心脏急性缺氧引起的猝死通常在发作数小时, 甚至是1 h内死亡[16], 此时难以在尸检和组织学检查或是传统生物学指标中发现特征性改变, 而本研究发现心血中miR-499在心梗1 h出现明显变化, 对AMI猝死的法医学诊断具有重要意义。

在法医学领域, 腐败、自溶等死后变化及死后微生物生成是限制临床生化指标应用于案件鉴定的重要因素。有研究证明, miRNA 因具有耐高低温、不易降解等特点, 可在血液中稳定存在[17]。因此, 本研究为了证明miR-499死后稳定性, 比较了不同死亡时间对miR-499的影响, 笔者发现虽然两组数据变化趋势大体相同, 但心梗1 h组的miR-499相对表达倍数在早期死亡时间均显著高于断颈死亡组, 这说明心梗对miR-499升高的影响大于死后因素, 并且死亡间隔时间越短, miR-499倍数升高越明显。根据本研究结果, 在死亡时间3 h内, 检测miR-499含量具有提示急性心梗的价值。在实践中, 猝死、中毒、窒息等死因均可出现体表损伤轻微甚至缺如, 脏器显微病理常表现缺血缺氧改变, 导致死因诊断困难。本次研究分别利用断颈、麻醉过量、结扎气管的方式模拟机械性损伤、气体中毒及机械性窒息, 与心梗组血浆中miR-499进行比较, 验证miR-499诊断心梗的能力。研究发现, 虽然与断颈死亡组比较, 心梗1 h血浆miR-499含量未见统计学差异, 但心梗1 h血浆中的miR-499含量明显高于麻醉死亡和窒息死亡（P< 0.05）。综合miR-499死后稳定性研究结果, 心梗死亡导致的miR-499含量升高现象会随着PMI延长更加明显。因此笔者认为, miR-499具有区分不同死亡原因的潜在价值。

本研究通过分析在不同心梗时间、心梗后不同死亡时间以及不同死因中miR-499的含量变化发现：miR-499在心梗1 h达到峰值且不易受到死后因素影响; 心梗后miR-499的含量高于断颈、窒息以及麻醉过量死亡, 且随着PMI的延长miR-499含量升高现象会更加明显, 这提示miR-499有望成为辅助法医诊断AMI的新指标。

参考文献
[1] 赵开放, 李洋, 王坚, 等. microRNA在急性心肌梗死法医学诊断中的应用前景[J]. 中国法医学杂志, 2019, 34(1): 74-78.
(ZHAO Kaifang, LI Yang, WANG Jian, et al. Application prospect of microRNA in postmortem diagnosis of acute myocardial infarction[J]. Chinese Journal of Forensic Medicine, 2019, 34(1): 74-78. ) [本文引用:1]
[2] SCHULE C, ZELLER T. MicroRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease-summing up the facts[J]. Cardiovascular Diagnosis & Therapy, 2015, 5(1): 17-36. [本文引用:1]
[3] ZHU H, FAN G C. Role of microRNAs in the reperfused myocardium towards post-infarct remodeling[J]. Cardiovascular Research, 2012, 94(2): 284-292. [本文引用:2]
[4] CORSTEN M F, DENNERT R. Circulating microRNA-208b and microRNA-499 reflect myocardial damage in cardiovascular disease[J]. Circulation: Cardiovascular Genetics, 2010, 3(6): 499-506. [本文引用:1]
[5] WANG Q, MA J, JIANG Z, et al. Identification of microRNAs as diagnostic biomarkers for acute myocardial infarction in Asian populations[J]. Medicine, 2017, 96(24): e7173. [本文引用:1]
[6] YUNHUI C, NING T, JIAN Y, et al. A translational study of circulating cell-free microRNA-1 in acute myocardial infarction[J]. Clinical Science, 2010, 119(2): 87-95. [本文引用:1]
[7] LI Y Q, MF Z, HY W, et al. Comparing the diagnostic values of circulating microRNAs and cardiac troponin T in patients with acute myocardial infarction[J]. Clinics, 2013, 68(1): 75-80. [本文引用:1]
[8] MUNTNER P, HE J, HAMM L, et al. Renal insufficiency and subsequent death resulting from cardiovascular disease in the United States[J]. Journal of the American Society of Nephrology, 2002, 13(3): 745-53. [本文引用:1]
[9] CHEN Z, LI C, LIN K, et al. MicroRNAs in acute myocardial infarction: evident value as novel biomarkers[J]. The Anatolian Journal of Cardiology, 2018, 19(2): 140-147. [本文引用:1]
[10] 孙启凡, 李冉冉, 胡胜, 等. 应用分子生物学技术鉴定体液斑迹组织来源的研究进展[J]. 刑事技术, 2018, 43(1): 47-52.
(SUN Qifan, LI Ranran, HU Sheng, et al. Progress and prospect of identifying body fluid source by molecular biology approaches[J]. Forensic Science and Technology, 2018, 43(1): 47-52. ) [本文引用:1]
[11] 易健明, 屈武斌, 张成岗. 实时荧光定量PCR的数据分析方法[J]. 生物技术通讯, 2015, 26(1): 140-145.
(YI Jianming, QU Wubin, ZHANG Chenggang. Data analysis methods of real-time fluorescent quantitative PCR[J]. Letters in Biotechnology, 2015, 26(1): 140-145. ) [本文引用:2]
[12] PETIER H J, LATHAM G J. Normalization of microRNA expression levels in quantitative RT-PCR assays: identification of suitable reference RNA targets in normal and cancerous human solid tissues[J]. RNA, 2008, 14(5): 844-852. [本文引用:1]
[13] ZHU J, YAO K, WANG Q, et al. Ischemic postconditioning-regulated miR-499 protects the rat heart against ischemia/reperfusion injury by inhibiting apoptosis through PDCD4[J]. Cellular Physiology & Biochemistry, 2016, 39(6): 2364-2380. [本文引用:1]
[14] 辛金海, 姚春霞, 丁敏, 等. 急性心肌梗死早期诊断中血浆microRNAs的标准化检测及临床意义[J]. 现代中西医结合杂志, 2017, 26(9): 68-70.
(XIN Jinhai, YAO Chunxia, DING Min, et al. Stand ardized detection and clinical significance of plasma microRNAs in early diagnosis of acute myocardial infarction[J]. Modern Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, 2017, 26(9): 68-70. ) [本文引用:1]
[15] WANG G K, ZHU J Q, ZHANG J T, et al. Circulating microRNA: a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans[J]. European Heart Journal, 2010, 31(6): 659-666. [本文引用:1]
[16] AL-KHATIB S M, SANDERS G D, GILLIAN D, et al. Preventing tomorrow's sudden cardiac death today: dissemination of effective therapies for sudden cardiac death prevention[J]. American Heart Journal, 2008, 156(4): 613-622. [本文引用:1]
[17] MITCHELL P S, PARKIN R K, KROH E M, et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of American, 2008, 105(30): 10513-10518. [本文引用:1]