引用本文
丰蕾, 季安全, 李彩霞. 基于DNA甲基化的年龄推断[J].刑事技术, 2020,45(4):433-435
FENG Lei, JI Anquan, LI Caixia. DNA Methylation-based Age Inference: Case Report[J]. Forensic Science and Technology,2020,45(4): 433-435  
Doi: 10.16467/j.1008-3650.2020.04.023
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基于DNA甲基化的年龄推断
丰蕾, 季安全, 李彩霞
公安部物证鉴定中心,法医遗传学公安部重点实验室,北京100038

第一作者简介：丰蕾,女,山西应县人,博士,副主任法医师,研究方向为法医遗传学。E-mail: fengleink@163.com

摘要

通过现场血斑进行个体年龄推断是犯罪现场分析中的难题。DNA甲基化为这一问题的解决提供了一种可能性,作为基因组中胞嘧啶上的一种共价修饰,其被认为是目前用于年龄推断准确性最高的一种分子标记。本文利用实验室前期研究建立的年龄推断方法,通过检测9个甲基化位点,对一起积案中保存9年的血斑样本检测并成功推断出了血斑来源个体的年龄,与案犯实际年龄几乎一致。基于DNA甲基化的年龄推断在该案例的成功应用,证明基于DNA甲基化的年龄推断方法对于案件侦破具有一定的应用价值和指导意义。

关键词: 法医遗传学; 年龄推断; DNA甲基化
中图分类号:DF795.2 文献标志码:B 文章编号:1008-3650(2020)04-0433-03
DNA Methylation-based Age Inference: Case Report
FENG Lei, JI Anquan, LI Caixia
Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security (MPS) & MPS’ Key Laboratory of Forensic Genetics, Beijing 100038, China
Abstract

Inferring an individual’s age from sole bloodstain is difficult in crime scene analysis. DNA methylation, the covalent modification of cytosine in genomic DNA, provides a possibility for solving the above-indicated problem, therewith being boasted as the current most accurate molecular marker for age inference. This paper was about using the DNA methylation-based age inference that has been established through our laboratory’s recent researches, so as to have successfully inferred the age of the donor of one bloodstain stored for 9 years. The inferred age is nearly consistent with the actual age of the offender. Such a successful application, exampling with the here-reported case solved through age inference based on DNA methylation, proves that the DNA methylation-based age inference is feasible for case investigation, providing a new technical choice for personal age inference about cases.

Key words: forensic genetics; age inference; DNA methylation

犯罪现场分析包括作案的人数、过程、动机以及案犯特征刻画[1]等内容, 其中推断案犯个体年龄是案犯特征刻画的重要组成部分。法医人类学中可以通过检测骨骼、牙齿等骨性指征, 运用人类学模型, 计算或推断个体年龄[2, 3], 该方法需要骨骼牙齿等硬组织存在; 依靠刑侦专家通过案件现场分析也可以推断案犯年龄, 但具有一定的主观性。DNA技术应用于侦查破案和刑事诉讼以来, 从STR单一分子标记向SNP、DNA甲基化等多种分子标记扩展, 应用范围从个体识别向个体特征刻画方向纵深推进。在很多犯罪现场会遗留有软组织碎片、脱落细胞、唾液、血液、精斑等检材, 这些检材不具有形态学信息, 目前主要是通过检测与年龄相关的生物大分子标记来进行年龄推断, 如端粒长度、氨基酸消旋率、线粒体DNA的损伤等, 但这些分子标记由于与年龄相关性差而未应用于法医学实践中[4]。近年来, DNA甲基化分子标记被广为研究, 因其被证实与年龄具有良好的相关性, 可用于血斑等现场生物物证相关个体的年龄推断[5]。利用人体特定甲基化位点的甲基化值随年龄变化的规律, 能较为客观地推断年龄, 可与刑侦专家犯罪现场分析的年龄相互佐证。

在基因组中, DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的催化下, S-腺苷-L-甲硫氨酸提供 甲基与DNA的胞嘧啶共价结合, 形成5-甲基胞嘧啶(5mC)[6]。几乎所有的甲基化胞嘧啶都发生在CpG二核苷酸结构中。DNA甲基化值是从0到1的一个数值, 如在血液中, 0代表这个位点在血液中全部细胞中没有被甲基化, 1代表这个位点在血液中全部细胞中都被甲基化。MassARRAY检测技术是DNA甲基化靶向检测的一种常用方法, 它结合了碱基特异性酶切反应和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测原理, 可实现对甲基化程度的定量检测。

本案例使用的年龄推断方法由本实验室前期研究建立, 经基于MassARRAY检测技术检测9个位点的甲基化值构建多元线性回归模型而推断年龄, 其年龄推断的平均绝对偏差为2.8岁, 并在99份保存3个月的血斑样本中证实该方法适用于血斑样本的年龄推断[5, 7]。

1 资料与方法
1.1 简要案情

2008年10月发生一起杀人案, 当地公安技术人员现场提取到一个沾满血的纸片, 晾干后室温保存。2017年9月份送我实验室希望做年龄推断检验, 当年年底之前完成全部检验工作, 并于2018年初出具了年龄推断检验意见。前期STR检验证明该血液来源于一名未知男性个体, 怀疑为嫌疑人所留。

1.2 DNA提取

剪取纸片两处血斑, 每处约为2 cm× 2 cm, 由于血斑面积较大, 每处血斑平分为两管提取, 得到4份DNA样本。采用M48磁珠法提取基因组DNA, 最终洗脱体积为40 µ L。使用NanoDrop2000对提取DNA作定量。

1.3 STR分型检验

采用Identifiler STR试剂盒（美国ABI公司）, 对以上基因组DNA进行PCR扩增, 扩增产物经3500遗传分析仪（美国ABI公司）进行电泳检测, 采用GeneMapper ID V3.2软件进行STR分型。

1.4 DNA甲基化检测与年龄计算

提取的DNA合并使用, 共重复检测4次。每次检测中, 取1 µ g DNA使用EZ DNA methylationTM Kit试剂盒（美国Zymo公司）对样本DNA进行亚硫酸盐转化。使用NanoDrop2000对转化后DNA定量。取30 ng转化后模板进行PCR扩增, 使用EpiTYPER MassArray检测平台（美国Agena公司）检测9个位点的甲基化值[5, 7]。将9个位点的甲基化值输入前期研究开发的在线年龄推断网站(http://liufan.big.ac.cn/AgePrediction/), 直接推断出个体年龄。

2 结果
2.1 DNA定量

血斑虽在常温下保存达9年, 但提取获得的DNA量仍很大, 保证了后续甲基化检测的顺利进行。4份DNA定量结果见表1。

表1 四份DNA定量结果 Table 1 Quantification results of four DNA samples
2.2 STR分型

4份DNA样本的STR分型相同, 并且与案件送检单位检测获得的男性分型结果一致, 因而提取的DNA在年龄推断检测中可合并使用。

2.3 年龄推断

对提取的DNA重复检测了4次, 9个位点的甲基化值及年龄推断结果见表2。4次推断年龄分别为43.5岁, 39.8岁, 41.1岁和45.1岁, 最终平均推断年龄值为42.4岁, 根据前期建立的年龄推断模型, 推断误差为± 2.8岁。

表2 九个位点* 甲基化值及年龄推断结果 Table 2 Detected methylation values from the samples and the inferred ages derived throughout 9 selected loci
3 讨论

本案为积案, 现有物证和线索极少, 现场血斑是仅有的关键物证。案犯年龄信息可为缩小嫌疑人范围提供依据, 有助于案件现场分析与重建。本文年龄推断是在案件破获前完成, 并提供给案件调查分析所用。该案于2018年底破获, 作案时案犯年龄为41岁, 与本方法推断年龄基本一致。

关于年龄推断方法的重复性和准确性, 研究组前期对99份血斑样本独立重复检测了3次, 结果显示组间没有显著性差异[5], 取3次年龄推断的平均值, 在99份样本中计算得到的平均推断误差较三次独立推断的平均推断误差小, 证明多次重复检测推断年龄取平均值能提高年龄推断的准确性。因此, 本案使用4次推断年龄的平均值作为最终的推断年龄。当案件DNA样本有限, 只够做单次检验, 获得的推断年龄也可作为案件线索参考使用, 若有条件, 宜尽量做3次以上重复检测。

DNA甲基化用于年龄推断研究大多还是集中在血液或者比较新鲜的血斑样本中, 对于长期保存的陈旧血斑罕有报道。本案的成功应用证实了DNA甲基化的稳定性, 验证了其在积案中应用的可行性。因此, 本方法既可以应用于新发案件中, 又可作为一种新技术手段应用于积案中。

基于DNA甲基化的年龄推断方法作为一项全新的技术手段, 在案件中具有良好的应用前景[8]。DNA甲基化年龄推断用于实战包括以下几个方面：推断案犯年龄, 为犯罪现场分析和重建提供重要信息, 结合案件其他信息缩小嫌疑人排查范围; 用于无名尸体、块的年龄推断, 帮助尸源确定; 也可用于未知年龄个体的年龄估计。另外, 在用现场DNA作亲缘关系检索比对时, 如果能加入现场DNA个体的年龄信息选项, 则会大大缩小亲缘关系的搜索结果范围。

该技术目前仍处在发展的初始阶段, 距离成熟应用还需要更多的研究与推进拓广, 随着样本数据的积累, 年龄推断准确性和稳定性将会进一步提高, 年龄推断结果的表述也更加科学。原初DNA样本量大是目前最制约甲基化分析于法医学应用的技术瓶颈, 目前仅可在有条件的案件中应用。随着复合扩增体系的建立和二代测序技术的应用, 预期未来需要的DNA量会进一步下降至20 ng或以下, 届时该方法将会在案件中有更大范围的应用。在现阶段, 基于DNA甲基化的年龄推断结果, 仍需结合案件其他证据和信息综合研判分析应用, 从而防止将案件侦查引入歧途。

参考文献
[1] 闵建雄. 命案现场重建概论[M]. 北京: 中国人民公安大学出版社, 2006.
(MIN Jianxiong. An overview of the reconstruction of the scene of murder case[M]. Beijing: Chinese People’s Public Security University Press, 2006. ) [本文引用:1]
[2] SCHMELING A, GRUNDMANN C, FUHRMANN A, et al. Criteria for age estimation in living individuals[J]. International Journal of Legal Medicine, 2008, 122(6): 457-460. [本文引用:1]
[3] HILLEWIG E, DEGROOTE J, VANDERPAELT T, et al. Magnetic resonance imaging of the sternal extremity of the clavicle in forensic age estimation: towards more sound age estimates[J]. International Journal of Legal Medicine, 2013, 127(3): 677-689. [本文引用:1]
[4] MEISSNER C, RITZ-TIMME S. Molecular pathology and age estimation[J]. Forensic Science International, 2010, 203(1-3): 34-43. [本文引用:1]
[5] PENG F D, FENG L, CHEN J, et al. Validation of methylation-based forensic age estimation in time-series bloodstains on FTA cards and gauze at room temperature conditions[J]. Forensic Science International: Genetics, 2019, 40: 168-174. [本文引用:4]
[6] MIRANDA T B, JONES P A. DNA methylation: the nuts and bolts of repression[J]. Journal of Cellular Physiology, 2007, 213(2): 384-390. [本文引用:1]
[7] FENG L, PENG F D, LI S F, et al. Systematic feature selection improves accuracy of methylation-based forensic age estimation in Han Chinese males[J]. Forensic Science International: Genetics, 2018, 35: 38-45. [本文引用:2]
[8] 李姗飞, 王玲, 赵慧, 等. DNA甲基化检测与生物物证时间关联性研究进展[J]. 刑事技术, 2019, 44(4): 337-342.
(LI Shanfei, WANG Ling, ZHAO Hui, et al. Research progress on the relationship between DNA methylation detection and time association of biological evidence[J]. Forensic Science and Technology, 2019, 44(4): 337-342. ) [本文引用:1]