2018年某日下午, 某市小区一3个月大女婴被一个从天而降的苹果砸中头部致生命垂危。

1.2.1 DNA提取

苹果摔成了10碎块, 其中：有皮有肉7块、仅有肉2块、仅有皮1块。无法从外表判断是否曾被咬食过, 由于现场围观人员曾拾取个别苹果碎块, 故检材有被污染的可能。对10块苹果碎块分别单个提取, 粗糙面（果肉面）采用两步法棉签擦拭, 光滑面（果皮面）采用脱落细胞粘取器 ^[1]进行粘取, 共提取了17处检材, 包括果肉面擦拭物9个, 果皮面粘取物8个。分别剪取这些检材并装入1.5 mL离心管, 加细胞消化液400 μ L、10 mg/mL蛋白酶K 32 μ L, 56 ℃温浴1 h, 磁珠法（长春博坤磁珠, 20 μ L体积）提纯模板DNA, 30 μ L纯水洗脱并收集。

1.2.2 PCR扩增

第一次扩增：采用PowerPlex^® 18D System试剂盒在ABI Veriti型扩增仪扩增, 反应总体系10 μ L（模板DNA 6 μ L、Primer Pair Mix 2 μ L、Master Mix 2 μ L）, 扩增循环次数30次。第二次扩增：对3处检出分型的检材（碎块1、3和4果皮上的粘取物）, 采用同上试剂盒和扩增仪及扩增循环次数扩增, 反应总体系25 μ L（模板DNA 15 μ L、Primer Pair Mix 5 μ L、Master Mix 5 μ L）。扩增产物均在3500 xL分析仪（AB公司, 美国）进行毛细管电泳分离, 使用GeneMarker Forensic V1.9软件进行数据分析。

1.2.3 检验结果

17个检材中检出单一分型1处（图1和图2, 来自碎块3果皮, 用细胞粘取器提取检材）, 混合分型2处（图3和图4, 来自碎块1果皮; 图5和图6, 来自碎块4果皮。用细胞粘取器提取检材）, 其余均未检出。单一分型经与楼栋人员样本比对, 与11岁女童陈某（图7）一致。经查, 事发时陈某独自在家, 看到客厅一个被家里所养宠物狗咬过的苹果, 遂拾起（无咬食）将其投入阳台上喂食宠物狗的盘中, 不料苹果滚落至阳台台阶上, 并经过阳台台阶与护栏间空隙坠落而下, 刚好砸中女婴头部。

图1

Fig.1

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	图1 苹果碎块3检出的单一分型图谱（10μ L扩增体系）Fig.1 Single STR genotypes obtained with a 10μ L amplification reaction from the debris No. 3 of the fallen apple

图2

Fig.2

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	图2 苹果碎块3检出的单一分型图谱（25μ L扩增体系）Fig.2 Single STR genotypes obtained with a 25μ L amplification reaction from the debris No. 3 of the fallen apple

图3

Fig.3

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	图3 苹果碎块1检出的混合分型图谱（10μ L扩增体系）Fig.3 Mixed STR genotypes obtained with a 10μ L amplification reaction from the debris No. 1 of the fallen apple

图4

Fig.4

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	图4 苹果碎块1检出的混合分型图谱（25μ L扩增体系）Fig.4 Mixed STR genotypes obtained with a 25μ L amplification reaction from the debris No. 1 of the fallen apple

图5

Fig.5

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	图5 苹果碎块4检出的混合分型图谱（10μ L扩增体系）Fig.5 Mixed STR genotypes obtained with a 10μ L amplification reaction from the debris No. 4 of the fallen apple

图6

Fig.6

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	图6 苹果碎块4检出的混合分型图谱（25μ L扩增体系）Fig.6 Mixed STR genotypes obtained with a 25μ L amplification reaction from the debris No. 4 of the fallen apple

图7

Fig.7

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	图7 女童陈某分型图谱Fig.7 The STR genotypes of a female child surnamed of Chen

本案苹果落地变成了碎片, 无法判断是否曾有咬食及接触面, 故难以有针对性地提取人脱落细胞。而其作为直接证据, 必须有效采集并防止其在实验室内遭受二次污染。首先, 需对实验环境和器具进行清洁和消毒, 保证其在实验室内不受人源污染。其次, 苹果碎块提取的检材与人员样本分开进行实验, 以从源头上杜绝提取或扩增过程中混入外源DNA, 确保实验结果的可靠性。案发现场围观人员曾捡拾苹果碎片, 存在污染可能, 故提取勘查人员及围观人员样本并也作检验与入库, 以确保能够发现污染, 及时排除干扰峰, 从而保证实验结果可溯源, 检验过程符合法庭科学相关规定, 出具的鉴定意见能经得起推敲质疑。

为确保实验方法一次成功, 接到案件后, 实验人员并未立即检验, 而是通过模拟高空抛（坠）物试验（实验人员取苹果到水龙头冲洗, 未咬食从高空抛下, 苹果碎块表皮风干后, 分别用棉签、脱落细胞粘取器提取检材）, 采取不同的实验方法和策略, 探索最佳检验模式, 事实上, 借鉴模拟实验结果成为本案件成功检验的基础。

有效富集载体上靶细胞。苹果是否曾被咬食无从获知, 但苹果表面肯定有人触摸过。研究表明, 靶细胞易从表面光滑且坚硬的载体表层脱落, 从而降低DNA的提取模板量^[2]。Harbison^[3]统计不同载体表面接触DNA的检验成功率, 发现光滑坚硬的载体表面提取接触DNA的成功率最低。因此, 最大限度富集苹果碎块皮上的稀少靶细胞尤为关键。细胞粘取器具有粘附、转移脱落细胞能力强, 对大面积载体可多次粘取, 能强力富集脱落细胞等特点^[1], 相对于使用棉签两步擦拭法, 更能直观、快速地全覆盖提取面, 且操作更为可控、便捷。

合理提纯模板DNA。细胞消化液56 ℃温浴将细胞膜、核膜破坏, 适当延长温浴时间有利于裂解细胞核, 使DNA能更完全充分释放, 同时蛋白质的变性也更为彻底^[4]。磁珠法提取接触DNA等微量检材灵敏度较高, 提取的DNA物质分型完整、纯度高, 且不含色素、蛋白质等杂质^[5], 又便于去除100 bp以下的小片段DNA, 可减少STR扩增时出现的小片段优势现象。

合理选择扩增反应体系和循环次数。扩增体系扩大, 消除抑制因素能力会增强, 但会降低模板DNA的相对浓度, 造成合成 DNA的产物量不增加, 甚至降低^[6]。本案例通过不降低模板DNA的相对浓度（保持模板DNA、Primer Pair Mix、Master Mix比例不变）, 利用大体系扩增有利于消除抑制因素的特点, 获得了更好的分型图谱。比较图1至图7可发现, 25 μ L与10 μ L体系的分型结果虽差异不大, 但峰高存在3倍差异, 且25 μ L体系对大片段的分型结果更为均衡、清晰、可判断, 更符合行业标准。法医学实践中, 常规PCR循环数为28次, 适当增加循环次数, 可使DNA合成更充分, 从而提高灵敏度, 这已被许多人用于多种类型低拷贝检材的 DNA分析。但随着循环次数的增加, STR分型结果中易出现等位基因扩增不均衡、影子带和等位基因丢失等现象, 同时实验室环境和操作污染对样本STR分型的干扰作用也会变得更加明显^[7]。研究显示循环数增至34次甚至以上, 获得的STR分型不稳定^[6]。接触性检材DNA含量普遍在0.1~1.5 ng 之间^[8]。不同PCR扩增循环数的基因分型检测结果统计显示^[9], 对模板量大于0.062 5 ng的低拷贝模板基因分型检测结果, 30次循环数的检验结果优于28次, 且与32次循环数及以上的检测结果持平。

结合本实验室使用PowerPlex^® 18D System试剂盒扩增累积的经验（年扩增微量检材超1万份）, 本案例采用PowerPlex^® 18D System试剂盒25 μ L体系（模板15 μ L、Primer Pair Mix 5 μ L、Master Mix 5 μ L）, 30次扩增循环次数进行PCR扩增, 获得的STR分型结果稳定、正确, 且非特异谱带与pull-up峰影响小。

检材未及时送检。案发5 d后, 因各种手段仍无法侦破案件, 办案单位才委托DNA检验。表皮细胞离体后会产生自溶, 使DNA降解, 一般72 h内自溶和降解速率影响因素较小, 而超过该期限则会加快溶解速率^[10]。本案送检时, 检材DNA已部分降解, 这增加了检验难度。

模板DNA未进行定量和平行扩增。案件的成功检验建立在模拟实验、参考梯度扩增结果及日常检验微量检材经验的基础上。鉴于客观原因, 并未进行DNA定量, 案件采取30 μ L洗脱体积, 实际收回约23 μ L, 为确保实验成功, 并未在第一次就采取平行扩增方式, 而是采用了不同体系的扩增方式, 共用去了21 μ L模板DNA, 因此, 后续未再做平行扩增实验。如此就缺少对模板DNA的精准定量和平行扩增结果的比较, 这不利于后期经验总结和理论分析。

楼栋及围观人员样本未能一次采齐送检。距第一次送检2 d后, 第二批采集送检的人员样本才包含有女童陈某。这不利于快速破案, 且会因存在漏采、慢采情况, 导致无法发现肇事者。

高空抛（坠）物案件近年来频有发生, 能找出肇事者的寥寥无几, DNA技术的进步为该类案件侦破开启了一扇门。检验此类案件, 须将防污染的理念贯穿于整个实验全程, 及时保护现场物证并采集相关人员的样本送检, 根据检材特点采取不同的提取与检验方法, 先行模拟试验优化检验策略, 将有助于提高检验成功率。