显微拉曼技术是将RS分析技术和显微分析技术结合起来的一种应用技术, 不仅具有常规RS的特点, 更具有成像技术和较高的空间分辨率, 激发光透过显微镜聚焦于样品上, 可实现对1 μ m× 1 μ m× 5 μ m三维微区精确分析^[6]。

曹玲等^{[7, 8]}实验研究表明, 通过优化仪器参数, 如选择合适的激光功率、光栅、激发波长（532、633、783.8 nm等）, 同时利用显微拉曼的微区成像技术, 观察样本颜色、背景等不同进行逐点寻找, 仅选择非法添加物的微粒进行检测, 对采集的RS谱图使用Labspec软件, 对荧光背底进行拟合和扣除, 能够更有效地减少降糖药BDS和壮阳药BDS中的基质干扰, 确定主要特征峰的谱峰位移频率和结构归属, 由此建立了降糖药BDS中盐酸二甲双胍、盐酸苯乙双胍、格列美脲、格列本脲等双胍类和本脲类非法添加化药的共聚焦显微拉曼检测方法; 同时其研究建立的壮阳药BDS中枸橼酸西地那非、他达那非等磷酸二酯酶5型（PDE5）抑制剂类非法添加化药的共聚焦显微拉曼检测方法, 采集时间仅需10~15 s, 在市场抽样的检测比对阳性结果均得到LC/MS-MS验证。姚辉^[9]根据对市场上BDS的调研后进一步研究发现, 结合偏光显微镜可将样品中掺杂的可疑晶体形态物质初步分捡后收集, 再用显微拉曼可实现微米级样本的聚焦检测, 能够更为高效地分辨BDS样品中掺伪少量的盐酸二甲双胍和盐酸西布曲明两种非法添加化药。该方法利用非法添加化药在显微镜下的形态差异性以及显微拉曼的微区精确分析特点, 对于添加剂量少或添加种类多的BDS样本的快速检测具有明显优势。此外, 邵德佳^[10]和王玮^[11]等初步探索了显微拉曼技术运用于兽药中非法添加化药的检测研究, 实验得出的显微拉曼谱图及其特征归属信息可作为恩诺沙星和氟苯尼考及其制剂的定性鉴别的科学依据。但由于BDS成分复杂, 即使是微量杂质也可能产生很强的荧光成为检测的不利因素, 有时选择最佳的共聚焦检测条件尽量避免, 实际上结果也不尽如人意, 因此, 消除荧光干扰的处理技术, 如SERS成为学界研究的重要内容。

表面增强拉曼（SERS）是指当一些分子被吸附到某些粗糙的金属 （如银、铜、金等） 表面上时, 其拉曼散射强度会增加104~106倍, 甚至高达1 014~1 015倍, 弥补常规拉曼检测灵敏度低的问题, 理论上可实现单分子检测^{[12, 13]}。实践中发现, BDS中的中药成分产生的强荧光是拉曼散射的“ 硬伤” , SERS一方面能够大大降低其荧光干扰, 另一方面能够大大增强含有π 键、孤电子对和环结构的目标物分子的拉曼信号, 甚至可达10ⁿ倍。

在降糖类BDS中的非法添加化药的分析研究中, 张雁等^{[14, 15, 16]}采用胶体银颗粒作为SERS试剂, 通过实验发现, 当pH呈偏酸性条件下有利于马来酸罗格列酮与盐酸吡咯列酮的鉴别; 当pH呈偏碱性条件下有利于马来酸罗格列酮、盐酸苯乙双胍和盐酸二甲双胍的鉴别。王琳等^[17]在此基础上, 采用胶体金颗粒对实际降糖类BDS中进行检测, 并建立了BDS中添加的盐酸吡格列酮、盐酸罗格列酮和盐酸苯乙双胍的SERS快筛方法, 前处理与检测时间总共只需15 min。郭焱等^[18]通过对减肥药中非法添加的盐酸西布曲明与盐酸芬氟拉明进行RS和SERS的对比研究表明, 酸性条件下的SERS效果最为理想。吴国萍等^{[19, 20]}则采用自制纳米金试剂与厂家提供的SERS试剂对比, 考察了不同酸度、不同酸种、不同纳米金等因素影响, 在实际样品中检出西地那非、马来酸罗格列酮和盐酸吡咯列酮灵敏度和准确度高, 效果良好。张建红等^[21]结合RS初筛、光谱叠加分析和SERS, 开发了西地那非和他达拉非的特征拉曼筛查方法, 通过对市面上132种补肾壮阳类BDS进行验证, 准确率大于95%。与此同时, 张雁等^{[22, 23]}还首次实现了无需经过提取分离, 在同一SERS体系中对多种微量化药成分的快速识别, 建立了复杂混合体系中减肥类、降糖类、降压类这3个品种BDS中十几个化药成分的快速筛查检测方法。

随着新技术的不断革新, RS技术在定量检测能力方面也逐渐发展, 李志成等^[38]建立的酚酞-甲醇溶液标准曲线法能够对添加不同浓度酚酞的减肥类BDS进行RS定量检测, 该方法的检出限为1%。

随着检验内容的不断变化, 对于体内摄入BDS非法添加化药的检测技术越来越受到关注, 针对镇静安神类非法添加化药, Doctor等^[39]利用液液萃取（LLE）作为SERS检测的生物样本前处理方法, 建立了尿液中苯二氮卓类药物的LLE+SERS检测方法, 检出限达0.032~0.6 μ g/mL。随后, Hassanain等^[40]建立并优化高效液相色谱参数, 并通过研究表明, 纸质基底SERS传感器具有比二极管阵列检测器（DAD）更高的灵敏度和与质谱仪相似的选择性, 进而提出了HPLC+SERS联用技术在快速测定生物体液中非法添加药物及其代谢物方面的应用前景。由于SERS对目标分析物具有很强的专属特异性, 恰好弥补了HPLC对代谢物鉴别中存在的局限性, Subaihi等^[41]在最近的研究中发现, 尿液样本经液相色谱在线梯度洗脱, 并以合适的流速在洗脱液中注入表面增强试剂, 进而采用SERS多采集模式实现对洗脱液混合物中目标代谢物的精确定量, 该研究表明HPLC+SERS联用技术在生物体液中的非法添加药物及其代谢物检测方面有可能成为重要技术手段。

作为新兴的快速检测方法, RS技术因其无损、简便、灵敏等独特优势成为BDS中非法添加化药检测领域近几年的研究热点。然而该技术在未来的发展中仍存在许多问题亟待解决：1）SERS技术以具有降低基质荧光干扰、提高目标物拉曼信号的明显优势目前被广泛研究应用, 但一方面SERS基底重现性和稳定性是学界的研究难点, 另一方面SERS基底种类纷繁复杂, 通常是针对一种或几种相似目标物自主研究开发SERS基底, 导致成本高而又无法进行标准化生产, 因此很难建立快速检测的通用方法。2）BDS中非法添加量减少、种类增多、掺杂物随意, 样本的基质干扰是RS直接检测的局限性, 对样本进行适当的前处理能够提高检出率, 因而前处理联用技术、分析仪器联用技术是发展的必然趋势, 如TLC + SERS、LLE+SERS、UPLC + SERS等。但前处理技术一般操作复杂、耗时长, 对人员的专业技能要求高, 稍有疏漏容易损失目标物, 很难普遍适用现场进行快筛的实战需求。3）根据文献资料, 我们虽然能够查询到几十种常见非法添加化药的RS图, 但目前尚无途径能够共享学者已经建立的RS数据库。因此在实际检测中, 对于已知目标物的情况下, 我们仍需重新建立目标物数据库才能进行比对, 此项工作重复繁重; 与此同时, 也正是由于缺乏完整的非法添加化药的RS数据库, 对于样本中的未知物则几乎无法检测。

综上所述, 为了解决当前公安工作有效打击BDS中非法添加化药案件的迫切需求, 建立一套通用性强、操作简便、准确高效的RS检验方法应当针对以下几个方面进一步研究发展：1）共聚焦显微拉曼、SERS-CI、UPLC + SERS等精密设备联用技术适合实验室的高灵敏度精确筛查, 可以作为非法添加化药的最终确证手段之一, 着重解决基质组分复杂、痕量目标物和未知物分析检测等难题; 手持拉曼携带方便, 分析速度快、操作简便, 适合对现场海量样本的快速筛查, 初步判断目标物或所属种类, 满足基层实战应用需求。2）通过对SERS机理的深入认识, 合成尺寸均一、重现性好、灵敏度高的SERS活性基底; 通过对非法添加化药的特性结构分类进行SERS检测并优化SERS活性基底, 从而研制出可标准化和商业化生产的靶向SERS试剂包, 既降低成本又准确高效, 具有较高的推广应用前景。3）前处理联用技术精简化, 实现提取、振荡、离心、分离等步骤一体化、自动化、标准化, 从而设计研发操作简单、携带方便的相关设备, 以更好应对各类样本检材, 如食物、饮料、呕吐物等。4）加快建设非法添加化药的RS数据库和SERS数据库。通过广泛收集汇总学术成果中的谱图数据源, 完善判别模型, 建立可搜索、可操作的数据库和网络平台, 并在全国公安实现共享。5）加快建立广谱筛查的检验方法, 制定非法添加化药的检验技术标准。借鉴目前国内外文献在医药领域对BDS中的非法添加化药的检测分析方法, 从现场快速筛查和法庭科学检验鉴定角度, 有关科研机构分别侧重制定现场广谱筛查标准方法和法庭科学实验室检验BDS中非法添加化药的行业技术标准, 并尽快推广应用。概言之, RS技术不仅为BDS非法添加案件所面临的侦查困境提供了夯实的技术支撑, 更重要的是填补了法庭科学领域对环食药犯罪案件检验鉴定的空白, 为类似案件的司法审理提供了有力的法庭证据。