引用本文
于交远, 王瑞花, 常靖, 张高剑, 陈纯华, 金东海. 液液萃取法分析血液中劳拉西泮[J].刑事技术, 2020,45(4):383-386
YU Jiaoyuan, WANG Ruihua, CHANG Jing, ZHANG Gaojian, CHEN Chunhua, JIN Donghai. Analysis of Lorazepam in Blood by Liquid-liquid Extraction[J]. Forensic Science and Technology,2020,45(4): 383-386  
Doi: 10.16467/j.1008-3650.2020.04.011
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液液萃取法分析血液中劳拉西泮
于交远1, 王瑞花2,*, 常靖2, 张高剑3, 陈纯华1, 金东海1
1.呼伦贝尔市公安局刑事科学技术支队,内蒙古 呼伦贝尔 021001
2.公安部物证鉴定中心,北京 100038
3.南阳市公安局犯罪侦查支队刑事技术大队,河南 南阳 473001
* 通讯作者简介：王瑞花,女,山西运城人,硕士,研究员,研究方向为毒物分析。E-mail: nqkczs@126.com

第一作者简介：于交远,男,吉林白山人,学士,工程师,研究方向为理化分析。E-mail: yujiaoyuan@163.com

基金资助: 公安部技术研究计划（2018JSYJC10); 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（2018JB013)
摘要

目的 采用液液萃取法萃取血液中劳拉西泮,经气相色谱质谱仪和液相色谱质谱仪检测,比较两种仪器在分析劳拉西泮时的差异,并建立血液中劳拉西泮的检验方法。方法 取血液1.00mL,加入3.00mL乙酸乙酯振荡提取,离心,分离有机相,在45℃吹干,0.10mL甲醇定容,上样分析。根据保留时间、特征离子及相对丰度比进行定性,以特征离子峰面积进行定量。结果 血液中1.00µg/mL劳拉西泮提取液在气相色谱质谱仪上无响应,50.0ng/mL在液相色谱质谱仪中回收率在80%~103%。结论 血液中劳拉西泮的检测不适宜用气相色谱质谱进行分析,本文建立的液液萃取-液相色谱质谱检验方法简便、快速、灵敏,适用于抢劫、强奸案件中劳拉西泮的检测。

关键词: 法医毒物学; 劳拉西泮; 液液萃取法; GC-MS; LC-MS; 基质效应; 血液
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2020)04-0383-04
Analysis of Lorazepam in Blood by Liquid-liquid Extraction
YU Jiaoyuan1, WANG Ruihua2,*, CHANG Jing2, ZHANG Gaojian3, CHEN Chunhua1, JIN Donghai1
1. Criminal Division of Science and Technology of Hulunbuir Public Security Bureau, Hulunbuir 021001, Inner Mongolia, China
2. Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing 100038, China
3. Criminal Technology Brigade of Criminal Investigation Detachment of Nanyang Public Security Bureau, Nanyang 473001, Henan, China
Abstract

Objective To isolate with liquid-liquid extraction into the lorazepam that is to analyze through gas/liquid chromatography-mass spectrometer (GC-MS/LC-MS) so that the comparison can be conducted into the difference between the two instrumental analyses of lorazepam, thus having rendered a method to detect lorazepam in blood.Methods Lorazepam-spiked sampling blood (1.00mL) was disposed with ethyl acetate (3.00mL) under vibration, afterwards centrifuged to separate the organic phase that was firstly dried at 45℃ and then dissolved with 0.1mL methanol. The dissolved substance (lorazepam) was analyzed into GC-MS/LC-MS, with its retention time, characteristic ions and relative abundance ratio being qualitatively determined plus the peak area of characteristic ions being quantified.Results For the sampling blood containing lorazepam of 1.00µg/mL, no responsiveness was turned up from GC-MS, yet LC-MS was revealing the lorazepam recoveries of 80%~103% when the lorazepam was even lowered to 50.0ng/mL.Conclusions The gas chromatography-mass spectrometry is not suitable for detection of lorazepam in blood. Reversely, the liquid-liquid extraction coupling with liquid chromatography-mass spectrometry is eligible for the purpose, demonstrating its simple, rapid and sensitive merits in tackling into the relative cases of robbery and/or rape.

Key words: forensic toxicology; lorazepam; liquid-liquid extraction; GC-MS; LC-MS; matrix effect; blood

劳拉西泮（Lorazepam）临床上作为催眠、镇静和抗癫痫药物, 常被犯罪分子用于麻醉抢劫、强奸等违法犯罪。文献报道血中劳拉西泮的检测方法主要为高效液相色谱法[1, 2]、气相色谱法[3, 4]和液相色谱-串联质谱法[5, 6]。笔者通过比较不同方法, 发现1.00 µ g/mL劳拉西泮提取液在气相色谱质谱仪上无响应, 将样品转移至液相色谱质谱上, 发现具有响应。因此, 本论文就存在问题进行实验比较, 主要分析血中劳拉西泮在液液萃取后, 用气相色谱质谱仪和液相色谱质谱仪分析后的差异性, 并建立血液中劳拉西泮的液相色谱质谱方法。

1 材料与方法
1.1 仪器和试剂

Agilent 1260-6420 LC/MS/MS 仪器, Agilent 6890-5975i GC-MS 仪器, 劳拉西泮标准溶液（1.00 mg/mL）, 水为娃哈哈纯净水, 甲醇、乙腈为色谱纯, 其余试剂均为分析纯。

1.2 标准溶液配制

将劳拉西泮标准溶液1.00 mg/mL根据实验需要, 用甲醇逐级稀释, 在4 ℃冰箱中保存。

1.3 样品的制备

取样品1.00 mL于15 mL塑料离心管中, 用3.00 mL乙酸乙酯振荡提取10 min, 离心（5 000 r/min）10 min, 45 ℃下吹干, 用0.10 mL甲醇溶解定容, 供GC-MS、LC-MS分析。

1.4 色谱质谱条件

1.4.1 GC-MS 条件

仪器：Agilent 6890-5975i GC-MS; 离子源：EI; 采集方式：Scan和SIM; 色谱柱：HP-5MS, 30 m× 0.25 mm× 0.25 μ m; 柱温：柱起始温度为100 ℃, 保持2 min; 以 30 ℃/min的速率升至280 ℃, 保持17 min; 进样口温度：280 ℃; 离子源温度：230 ℃; 传输线温度：280 ℃; 分流比：10:1; 载气：高纯氦气; 流量1.0 mL/min。

1.4.2 LC-MS 条件

色谱柱：Agilent Eclipse Plμ s C18（2.1 mm× 50 mm× 1.8 μ m）; 柱温：35 ℃; 流动相：0.1%甲酸水溶液（A）:乙腈(B); 流速：0.25 mL/min; 进样体积：5.0 μ L; 洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱条件 Table 1 Gradient-eluting conditions

离子化方式：ESI; 采集模式：多反应监测（MRM）, 目标物选择2个母离子/子离子对作为定性离子对, 具体质谱参数及参考保留时间见表2。

表2 劳拉西泮的检测参数 Table 2 Mass spectral parameters of lorazepam
2 结果与讨论
2.1 血液中劳拉西泮GC-MS、LC-MS分析的差异性

按照1.4.1条件, 测定10.0 μ g/mL 标准物质、血液基质添加样品（10.0 μ g/mL, 将空白血液按照1.3进行提取、浓缩、吹干后, 添加适量劳拉西泮标准溶液的样品）、血液添加样品（1.00 μ g/mL, 在空白血液中添加适量劳拉西泮标准溶液使血液含有一定浓度的样品）、水质添加样品（1.00 μ g/mL, 在纯净水中添加适量劳拉西泮标准溶液使水质含有一定浓度的样品）。按照1.4.2条件, 测定2.00× 102 ng/mL标准溶液、血液基质添加样品（2.00× 102 ng/mL）、血液添加样品(2.00× 102 ng/mL)、水质添加样品（2.00× 102 ng/mL）。结果显示LC-MS标准溶液、血液基质添加、血液添加、水质添加样品均有响应; GC-MS标准溶液以及水质添加样品均具有响应, 血液基质添加及血液添加样品无响应, 从实验中可以看出血液基质添加样品质谱图中发现269特征离子峰, 未发现劳拉西泮特征离子峰274、302, 与标准物质不成相应的丰度比, 但在水质添加样品质谱图中, 相同保留时间内出现269、274、302特征离子峰（见图1）; 笔者将血液添加、血液基质添加稀释一定的倍数供LC/MS分析, 均检出劳拉西泮, 血液添加中劳拉西泮的回收率为93.6%~101.1%, 由此可推断GC-MS未检测到目标物质, 可能为基质效应引起。

图1 水质添加样品在GC-MS中的谱图（a：色谱图; b：质谱图）Fig.1 GC-MS spectrograms of water spiked with the sample (a: chromatographic spectrum; b: mass spectrum)

2.2 基质效应

针对实验中发现的问题, 笔者对GC/MS和LC/MS的基质效应进行考察, 毒物分析中最常用的基质效应评价方法是提取加入法。本实验测定标准品溶液的色谱峰面积（S1）和空白样品基质提取添加标准溶液后的色谱峰面积（S2）, 以比值S2/S1(%)来评价效应。本实验液液萃取-LC-MS法血液中的基质效应值在93.6%~101.1%之间; 液液萃取-GC-MS法血液中的基质效应值为0%, 在水中的基质效应在109%~118% 之间, 结果见表3。

表3 劳拉西泮在GC-MS和LC-MS的基质效应 Table 3 Matrix effects of lorazepam from GC-MS and LC-MS

通过上述分析可知：液液萃取法测定血液中劳拉西泮, 血液基质效应影响GC-MS分析, 血液中劳拉西泮的检测不适宜用GC-MS进行分析。

2.3 劳拉西泮液液萃取-LC-MS的分析与结果

2.3.1 专属性

建立并优化了检测劳拉西泮的LC-MS条件。经液相色谱质谱MRM模式检测空白血样、空白添加样品, 以320.9/274.9和320.9/303.0两个离子对、保留时间（tR=3.483 min）和已知劳拉西泮标准物质比对进行定性定量, 阴性对照无干扰; 结果表明LC-MS检测方法专属性较好。劳拉西泮的LC-MS色谱图见图2。

图2 劳拉西泮LC-MS色谱图（a：空白血样; b：空白添加样品, 50.0ng/mL; c：标准溶液, 50.0ng/mL）Fig.2 Chromatograms of lorazepam from LC-MS (a: blank blood; b: blank blood spiked with the lorazepam of 50.0ng/mL; c: standard solution of lorazepam at 50.0ng/mL)

2.3.2 线性范围和检出限

血样1.0 mL若干份, 分别加入适量的劳拉西泮, 使血液浓度分别在5.00、10.0、25.0、50.0、100.0、250.0 ng/mL, 按照1.3方法进行提取, 用0.50 mL甲醇定容后采用LC-MS进行分析, 以浓度对定量离子的峰面积进行线性回归, 得到劳拉西泮的回归方程式为：y=720.675x, 线性关系良好, R2=0.999 5。

检出限：于空白血样中加入一组低浓度（2.00 ng/mL）标准物质（n=7）, 按照1.3方法进行提取, 用0.50 mL甲醇定容后采用LC-MS进行分析, 测定方法最低检出限为 1.20 ng/mL, 以3倍检出限为定量下限, 定量下限为3.60 ng/mL。

2.3.3 回收率和精密度

取空白血样配制成低中高3个浓度（10.0、50.0、100.0 ng/mL）的血样, 每一浓度平行6份, 按照1.3方法进行提取, 用0.50 mL甲醇定容后采用LC-MS进行分析, 每个浓度同日内连续测定3次, 连续测定3 d, 计算回收率、日内精密度和日间精密度, 结果见表4。

表4 劳拉西泮的回收率和精密度（n=6） Table 4 Recoveries and precisions of lorazepam (n=6)

2.3.4 酸碱性（pH值）对劳拉西泮提取的影响

劳拉西泮属于苯骈二氮杂卓类药物, 此类药物多数属弱碱性, 笔者比较了不同pH条件下的提取效果, 见表5, 结果表明, pH值对血液中劳拉西泮的提取没有明显影响。

表5 pH值对劳拉西泮的影响 Table 5 Effect of pH value on extraction of lorazepam
3 小结

本文采用液液萃取法萃取血液中劳拉西泮, 经GC-MS和LC-MS分析, 血液（1.00 μ g/mL）液液萃取后在GC-MS上分析无响应, 不能满足实际工作需要, 在LC-MS分析中, 基质效应小、中性-碱性条件下数据稳定、重现性好、灵敏度高、具有良好效果, 可为公安部门侦破此类案件提供重要的技术支持。

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