引用本文
徐恩宇, 张云峰, 魏春明, 郭琳琳, 刘冰洁, 邹波, 于忠山. 涉案硝氯酚的色谱-质谱法快速检验[J].刑事技术, 2020,45(4):354-357
XU Enyu, ZHANG Yunfeng, WEI Chunming, GUO Linlin, LIU Bingjie, ZOU Bo, YU Zhongshan. Rapid Detection of Niclofolan with Chromatography-mass Spectrometry[J]. Forensic Science and Technology,2020,45(4): 354-357  
Doi: 10.16467/j.1008-3650.2020.04.005
Permissions
Copyright©2020, 《刑事技术》编辑部
《刑事技术》编辑部
涉案硝氯酚的色谱-质谱法快速检验
徐恩宇1,2, 张云峰1,*, 魏春明1, 郭琳琳3, 刘冰洁3, 邹波1, 于忠山1
1.公安部物证鉴定中心,北京 100038
2.中国医科大学法医学院,沈阳 110122
3.上海爱博才思分析仪器贸易有限公司,上海 203350
* 通讯作者简介：张云峰,女,河南范县人,硕士,副研究员,研究方向为法医毒理学。E-mail: yunfeng_2002@sohu.com

第一作者简介：徐恩宇,男,辽宁凌源人,硕士,讲师,研究方向为法医毒物分析。E-mail: xey626@163.com

基金资助: “十三五”国家重点研发计划（2017YFC0803504）; 中国医科大学校内基金（XZR20160033）
摘要

目的 建立超高效液相色谱-串联四级杆飞行时间质谱 (UPLC-QTOF) 和气相色谱-质谱（GC-MS）技术联合鉴定检材中硝氯酚的方法。方法 加标样品经甲醇提取,取上清液,采用UPLC-QTOF 和GC-MS进行分析。结果 GC-MS检测硝氯酚需要较高进样温度和较长时间得到特征碎片（344, 326, 298, 268和160）,且NIST 17中无该物质信息,易出现漏检。经UPLC-QTOF 检测,保留时间 4.99min,硝氯酚的[M-H]-峰为 m/ z 342.9538,碰撞诱导解离（CID）模式下二级质谱主要离子有 m/ z 296.9611,295.9529,260.9835,214.9903,279.9576,249.9598。结论 在目前缺少硝氯酚色谱-质谱检测信息且国内报道较少的情况下,本文为硝氯酚快速检测提供参考。

关键词: 法医毒物分析; 硝氯酚; 超高效液相色谱-串联四级杆飞行时间质谱; 气相色谱-质谱; 快速检验
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2020)04-0354-04
Rapid Detection of Niclofolan with Chromatography-mass Spectrometry
XU Enyu1,2, ZHANG Yunfeng1,*, WEI Chunming1, GUO Linlin3, LIU Bingjie3, ZOU Bo1, YU Zhongshan1
1. Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing 100038, China
2. School of Forensic Medicine, China Medical University, Shenyang 110122, China
3. AB Sciex Pte. Ltd, Shanghai 203350, China
Abstract

Objective To establish a method for identification of niclofolan by both GC-MS and UPLC-QTOF.Methods The sample was extracted with methanol, centrifuged to have the supernatant being subjected to analysis with GC-MS and UPLC-QTOF.Results For the GC-MS choice, niclofolan was necessary of undergoing into injection at higher temperature and longer time processing so as to have it detected, appearing its characteristic fragment ion peaks at m/ z 344, 326, 298, 268 and 160, yet no information obtained about it in the existing NIST 17, thus very prone to lead a missed check. In contrast, UPLC-QTOF method was able to determine niclofolan, showing of the niclofolan being retention time of 4.99min, its characteristic fragment ion peaks [M-H]- ( m/ z 342.9538) in the single stage and m/ z 296.9611, 295.9529, 260.9835, 214.9903, 279.9576, 249.9598 in the tandem (MS/MS) mode.Conclusion For the present lack of relevant information about the detection of niclofolan to cause difficulty of getting assistance, this paper should be providing a reference for the rapid detection of niclofolan.

Key words: forensic toxicological analysis; niclofolan; UPLC-QTOF; GC-MS; rapid detection

硝氯酚是拜耳公司生产的治疗牛羊肝片吸虫的特效药, 易对含有脂质的神经系统造成损伤, 可抑制体内三羧酸循环中的琥珀酸脱氢酶, 使有氧代谢受阻, 表现为脑水肿、中枢神经受损及视神经受损等症状[1, 2, 3]。报道的数例口服硝氯酚中毒的患者最终多因呼吸衰竭而死亡, “ 冰僵” 是硝氯酚中毒的特异表现, 致死率高[1, 3, 4, 5]。因误服或投毒硝氯酚而导致中毒甚至死亡的案例屡有报道[1, 2, 3, 4, 5]。目前, 硝氯酚的快速检测是毒物分析领域的一个挑战性工作, 已有报道多采用光谱法、色谱法检测硝氯酚药片、注射液或相关原料药含量[6, 7]。本文给出了超高效液相色谱-串联四级杆飞行时间质谱 (UPLC-QTOF)检测条件下硝氯酚成分的判定依据, 为高沸点药毒物的鉴定提供参考, 提示毒物分析工作者应注意疑似硝氯酚中毒案件中生物检材的选取及前处理方法的选择, 并与气相色谱-质谱（GC-MS）检验进行了对比。

1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂

QP-2010 Ultra 气相色谱质谱联用仪, GC-MS Solution 工作站（日本Shimadzu公司）; ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色谱仪（美国Waters公司）; TripleTOFTM 5600+ 高分辨四级杆-飞行时间质谱仪（美国SCIEX公司）。

硝氯酚对照品（Lot No. BS18V09051, 美国BOC Sciences 公司）; 甲醇、乙腈、甲酸和乙酸铵均为质谱纯试剂（美国 Fluka 公司）; Millipore Simplicity 185 超纯水系统（美国Millipore 公司）。

1.2 样品前处理

称取适量加标样品, 用甲醇配制成1 mg/mL硝氯酚溶液, 超声5 min, 8 000 r/min 离心5 min, 取上清液供GC-MS分析; 上清液再经0.1 %（体积分数）甲酸水溶液稀释, 配制成0.1 μ g/mL溶液供UPLC-QTOF分析。

1.3 色谱-质谱条件

GC-MS 条件：Agilent DB-5MS石英毛细管柱（30 m × 0.25 mm, 0.25 μ m）; 初始柱温60 ℃, 保持1 min, 以30 ℃/min升至280 ℃, 保持15 min; 载气为He, 流速1 mL/min; 分流进样, 进样量 1 μ L, 分流比10:1, 溶剂延迟2.5 min; 进样口温度280 ℃。EI电离模式, 能量70 eV, 离子源温度210 ℃; GC-MS 接口温度230 ℃, 扫描范围 m/z 40 ~ 460[8, 9]。

UPLC-QTOF条件：Waters ACQUITY UPLC HSST3（2.1 mm × 100 mm, 1.8 μ m）; 柱温 40 ℃。A相为20 mmoL乙酸铵和0.1 %（体积分数）甲酸缓冲液, B相为乙腈; 流速0.3 mL/min; 进样量5 μ L; 梯度洗脱程序见表1。DuoSpray 离子源, ESI- 模式, 离子源温度 600 ℃, 喷雾电压 5 500 V, 雾化气 345 kPa; 辅助加热气 345 kPa; 气帘气 210 kPa。扫描模式：TOF MS -IDA-TOF MS/MS, 获得一级和二级质谱数据。去簇电压80 V, 碰撞能量5 V, 扫描范围 m/z 100 ~ 1 000; 二级碰撞诱导解离（CID）模式, 碰撞能量 (35 ± 15) V, 扫描范围m/z 50 ~ 1 000[9, 10]。

表1 梯度洗脱程序 Table 1 Gradient of mobile phase
2 结果与讨论
2.1 GC-MS分析

加标样品提取液的总离子流色谱图及目标物的质谱图见图1~2。在所设GC-MS分析条件下, 目标物的保留时间为 11.9 min, 对应质谱碎片主要特征离子峰有 m/z 344、326、298、268、160, 主要碎片离子归属情况见图2, 在最新版 NIST 17 质谱库中检索发现未收录该物质。加标样品中硝氯酚浓度 0.5 mg/mL 时总离子流色谱图在11.9 min附近无明显信息, 需要较高浓度 1 mg/mL 才出现明显的信号响应, 且条件优化后灵敏度没有显著提高, 提示GC-MS不适用于低浓度硝氯酚检测, 推断可能与硝氯酚高沸点（424.9℃）、不易气化有关。

图1 GC-MS分析样品提取液的总离子流色谱图Fig.1 TIC of the sample from GC-MS

图2 GC-MS分析硝氯酚的质谱信息Fig.2 MS of niclofolan obtained from GC-MS

2.2 UPLC-QTOF 分析

在选定的UPLC-QTOF条件下, 测定硝氯酚（C12H6Cl2N2O6, 分子量343.959 74）, 加标样品（浓度为10 ng/mL）的提取离子流图见图3, 色谱峰出峰时间为4.991 min（4.418 min可能是同分异构体）, 色谱行为良好。在电喷雾负模式（ESI-）下, 对应保留时间高分辨一级质谱信息[M-H]-峰m/z 342.953 2（见图4a）, 推测分子元素组成为[C12H6Cl2N2O6, -H]-, 与硝氯酚[M-H]-理论值m/z 342.953 01偏差为0.58 ng/mL, 说明一级精确质量匹配良好。此外, 由软件自动分析得到, 实测一级质谱图的一组同位素峰342.953 2、343.956 3、344.950 4、345.953 8（见图4b）, 与硝氯酚[M-H]-的理论同位素峰形吻合, 确认高分辨一级质谱信息与实际相符。进一步根据实测二级碎片质谱信息进行结构推测。在二级质谱图中可看到5个主要碎片离子, 分别为M1 m/z 342.952 3, F1 m/z 296.960 1, F2 m/z 295.952 7, F3 m/z 279.958 7, F4 m/z 260.984 0, F5 m/z 249.958 8（见图4c）。

图3 UPLC-QTOF分析样品提取液的总离子流色谱图Fig.3 TIC of the sample through UPLC-QTOF

图4 硝氯酚的一级精确质量(a)、同位素信息(b)和二级质谱信息(c)Fig.4 MS of niclofolan obtained with ESI-QTOF in the MS1 (a), MS2 (c) mode and isotope distribution (b)

结合硝氯酚的结构式推测其高分辨二级质谱信息如下：F1为准分子离子的脱NO2峰, 即[C12H6Cl2NO4, -H]-, 理论值为296.960 1, 质量偏差为0; F2为[C12H5Cl2NO4, -H]-, 理论值为295.952 3, 质量偏差为1.4 ng/mL; F3为F1的脱OH峰, 即[C12H5Cl2NO3, -H]-, 理论值为279.957 4, 质量偏差为4.7 ng/mL; F4为F1的脱HCl峰, 即[C12H5ClNO4, -H]-, 理论值为260.983 4, 质量偏差为2.2 ng/mL; F5为F1的脱HNO2峰, 即[C12H5Cl2O2, -H]-, 理论值为249.959 4, 质量偏差为2.3 ng/mL; 具体数值如表2所示。推测硝氯酚的可能裂解途径见图5。

表2 ESI-CID 模式下Niclofolan 碎裂生成离子一览表 Table 2 Chemical formula, exact and accurate m/z values, and differences between exact and accurate masses for the protonated molecules and product ions obtained from niclofolan with ESI-QTOF

图5 硝氯酚的可能裂解途径Fig.5 Proposed fragmentation pathway for niclofola

综上所述, UPLC-QTOF在6 min内完成硝氯酚的色谱分析, 根据高分辨一级质谱图的一级精确质量数和同位素峰形以及二级碎片离子信息, 可确认该阳性检出峰为硝氯酚。

3 结论

本研究采用了色谱-质谱联用技术对硝氯酚实现了快速检验。GC-MS法需要较高温度和较长时间, 灵敏度低。所建立的UPLC-QTOF法仅需室温条件, 较短时间（6 min）就能实现硝氯酚的快速检测, 灵敏度较高（10 ng/mL, ESI-CID模式）, 可能与离子源温度（600 ℃）较高有关, 有利于形成更多带电离子, 提高灵敏度, 提示高沸点化合物检测可考虑提高离子源温度来增加灵敏度。若结合乙腈沉淀蛋白前处理方法, 同样适用于生物检材中硝氯酚的快速分析。经样品加标实验给出相应的色谱-质谱条件, 并分别给出气质和液质条件下硝氯酚成分的判定依据, 当基层毒物分析工作者面对突发疑似案件时, 可作为筛查参考。此外, 毒物分析工作中应注意目标物的理化性质（溶解性、沸点等）, 选择合适的样品前处理方法和仪器分析条件, 高沸点化合物检测方法的建立应该引起我国公安执法及司法技术检验部门的重视。

参考文献
[1] 徐升, 夏永庆. 1980~2015年硝氯酚中毒荟萃分析[J]. 中国现代医生, 2016, 54(9): 68-71, 75, 169.
(XU Sheng, XIA Yongqing. Meta-analysis of niclofolan poisoning in 1980-2015[J]. China Modern Doctor, 2016, 54(9): 68-71, 75, 169. ) [本文引用:3]
[2] 张谊, 王淑芬, 姚笠. 近十年硝氯酚中毒概况和临床分析[J]. 儿科药学杂志, 2003(5): 60-61. )
(ZHANG Yi, WANG Shufen, YAO Li. General situation and clinic analysis of toxicosis of nitrylochlorophenol during last ten years[J]. Journal of Pediatric Pharmacy, 2003(5): 60-61. ) [本文引用:2]
[3] 贾丽君, 王梅英, 王志刚, 等. 硝氯酚中毒病例救治临床分析[J]. 临床误诊误治, 2016, 29(6): 20-22.
(JIA Lijun, WANG Meiying, WANG Zhigang, et al. Analysis of treatment of niclofelan poisoning[J]. Clinical Misdiagnosis & Mistherapy, 2016, 29(6): 20-22. ) [本文引用:3]
[4] 徐升, 夏永庆. 血液灌流对硝氯酚中毒的疗效观察[J]. 中外医学研究, 2016, 14(10): 9-11.
(XU Sheng, XIA Yongqing. Effect observation of hemoperfusion in the treatment of niclofolan poisoning[J]. Chinese and Foreign Medical Research, 2016, 14(10): 9-11. ) [本文引用:2]
[5] ALI B H, HASSAN T, HAROUN E M, et al. The effect of niclofolan on desert sheep experimentally infected with immature fasciola gigantica[J]. Journal of Veterinary Pharmacology & Therapeutics, 2010, 8(4): 398-403. [本文引用:2]
[6] 孙婷婷, 田凯, 王洪礼, 等. 高效液相色谱-内标法测定碘硝酚原料及其注射液中碘硝酚的含量[J]. 分析测试学报, 2017, 36(8): 1038-1042.
(SUN Tingting, TIAN Kai, WANG Hongli, et al. Determination of disophenol content in bulk drug and injection by high performance liquid chromatography with internal stand ard method[J]. Journal of Instrumental Analysis, 2017, 36(8): 1038-1042. ) [本文引用:1]
[7] 王彬, 刘国姣, 严恒, 等. 牛羊肉中6种抗肝片吸虫药残留测定的HPLC-MS/MS方法研究[J]. 食品科技, 2019, 44(5): 335-339.
(WANG Bing, LIU Guojiao, YAN Heng, et al. Determination of 6 fasciolicide in beef and mutton using ultraperformance liquid chromatography-tand em mass spectrometry[J]. Food Science and Technology, 2019, 44(5): 335-339. ) [本文引用:1]
[8] 徐恩宇, 刘俊亭, 袁慧雅, 等. 新型精神活性物质5-F-APINACA和AB-CHMINACA的快速检测[J]. 分析试验室, 2017, 36(8): 869-872.
(XU Enyu, LIU Junting, YUAN Huiya, et al. Rapid detection of novel psychoactive substances 5-F-APINACA and AB-CHMINACA[J]. Chinese Journal of Analysis Laboratory, 2017, 36(8): 869-872. ) [本文引用:1]
[9] 钱振华, 杨虹贤, 刘翠梅. 苯二氮卓类新精神活性物质Flubromazolam的快速检测[J]. 分析试验室, 2018, 37(10): 1133-1136.
(QIAN Zhenhua, YANG Hongxian, LIU Cuimei. Rapid detection of designer benzodiazepine flubromazolam by GC-MS and UPLC-QTOF[J]. Chinese Journal of Analysis Laboratory, 2018, 37(10): 1133-1136. ) [本文引用:2]
[10] 李昕潼, 张云峰, 杨煜, 等. 超高效液相色谱-串联质谱法检验血斑中抗高血压药物[J]. 刑事技术, 2019, 44(2): 126-131.
(LI Xintong, ZHANG Yunfeng, YANG Yu, et al. Determining hypertension-resistant drugs in bloodstains by UPLC-MS[J]. Forensic Science and Technology, 2019, 44(2): 126-131. ) [本文引用:1]