引用本文
蔺大伟, 郑佳佳, 李秀云, 邵凯, 夏庆兵, 孙红雷, 李文海. 超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法检测血液中的痕量溴敌隆[J].刑事技术, 2020,45(3):266-269
LIN Dawei, ZHENG Jiajia, LI Xiuyun, SHAO Kai, XIA Qingbing, SUN Honglei, LI Wenhai. Detection of Trace Bromadiolone in Blood by UPLC-HRMS[J]. Forensic Science and Technology,2020,45(3): 266-269  
doi: 10.16467/j.1008-3650.2020.03.011
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超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法检测血液中的痕量溴敌隆
蔺大伟, 郑佳佳, 李秀云, 邵凯, 夏庆兵, 孙红雷, 李文海
泰安市公安局刑侦支队刑事科学技术研究所,山东 泰安271000

第一作者简介：蔺大伟,男,山东菏泽人,本科,工程师,研究方向为毒物毒品分析。E-mail: lindawei1976@163.com

摘要

目的 建立超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-HRMS）快速检测血液中的痕量溴敌隆的分析方法。方法 血液样品经1mL乙腈提取、沉淀蛋白,直接过膜净化进样。采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1mm×50mm×1.8μm）,以甲醇和含0.1%（体积分数）甲酸的水为流动相进行梯度洗脱,利用数据依赖二级扫描溴敌隆特征离子的精确质量数、同位素匹配、二级碎片信息和保留时间进行定性,全扫描外标标准曲线法定量。结果 溴敌隆在质量浓度范围内线性关系良好（相关系数 R2=0.997 4）,方法检出限为500ng/L,样品加标回收率为73.6%~87.3%,相对标准偏差为2.17%~5.69%（ n=6）。结论 该方法简单快速、灵敏度高、结果准确、可靠,利用该方法可以对溴敌隆中毒案（事）件中血液里的痕量溴敌隆成分定性定量。

关键词: 法医毒物分析; 超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱; 血液; 溴敌隆
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2020)03-0266-04
Detection of Trace Bromadiolone in Blood by UPLC-HRMS
LIN Dawei, ZHENG Jiajia, LI Xiuyun, SHAO Kai, XIA Qingbing, SUN Honglei, LI Wenhai
Institute of Criminal Science and Technology of Criminal Police Detachment of Taian Public Security Bureau, Taian 271000, Shandong, China
Abstract

Objective To establish a method of ultra-performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) for quick determination of trace bromadiolone in blood.Methods With 1mL acetonitrile, the sampling blood was extracted and precipitated of protein, afterwards being purified with membrane filtration. The purified sample was injected into a Waters ACQUITY UPLC HSS T3 capillary column (2.1×50mm×1.8μm) that was eluted with the gradient-running mobile phase of 0.1% formic-water (v/v) and methanol. The resultant data were qualitatively compared against the bromadiolone of its accurate mass, isotopic compatibility, fragmentation information and retaining time, with the full scan external standard curve handling for quantitative research.Results The detected bromadiolone had an effective internal correlation (R2=0.9974), with its average recovery being 73.6%~87.3% and RSD 2.17%~5.69% (n=6).Conclusion The obtained results demonstrated that the method is simple, rapid, sensitive, accurate and reliable, capable of being used for qualitative and quantitative analysis of bromadiolne in blood from the case of trace bromadiolone poisoning.

Key words: forensic toxicological analysis; ultra-performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS); blood; bromadiolone

溴敌隆, 化学名3-（4’ -羟基-3-香豆素基）-3-苯基-1-对溴联苯基丙醇, 别名乐万通, 是常见的第二代香豆素类慢性杀鼠药, 毒性较强。溴敌隆主要通过拮抗体内维生素K1, 阻碍肝内凝血酶原和依赖维生素K的凝血因子的合成, 使机体凝血功能发生障碍, 临床出现腹痛、恶心、呕吐、口鼻出血、皮下出血、尿血等症状, 严重可导致死亡。溴敌隆主要经口由胃肠吸收, 在人体血液、肝、肾中含量较高, 40%~97%以游离形式从尿中排出[1]。

近年来, 随着毒鼠强、氟乙酰胺等剧毒杀鼠剂的禁售, 使得溴敌隆等慢性杀鼠药越来越多应用于生活中, 由于使用方式的不当或故意食用、人为投毒的案（事）件也时有发生, 因此建立快速准确的痕量溴敌隆检验检测方法十分必要。文献中常见的检测溴敌隆的方法有高效液相色谱-质谱联用法[2]、高效液相色谱法[3]、气相色谱法[4]、气相色谱质谱联用法[5], 考虑到溴敌隆为大分子化合物, 常压下难气化, 且高于200 ℃易分解, 本文前处理用快速简单的液液萃取法[6], 检测采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法, 利用溴敌隆的精确质量数、保留时间、同位素分布、二级碎片离子等信息进行定性, 用全扫描模式外标标准曲线法进行定量。本实验快速简单、灵敏度高、结果准确, 可以对血液中的痕量溴敌隆成分进行定性定量分析。

1 实验部分
1.1 实验仪器

美国ThermoFisher公司Q Exactive Foucs液质联用仪, 德国IKA公司VORTEX2涡旋振荡器, 德国Sigma公司3K15高速离心机, 美国Millipore公司Milli-Q超纯水仪, 美国Waters公司ACQUITY UPLC HSS T3液相色谱柱。

1.2 实验用品

溴敌隆标准物质（公安部物证鉴定中心）, 甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯, 试验用水为超纯水。

1.3 实验步骤

1.3.1 标准溶液的配制

用甲醇将溴敌隆配制成质量浓度1 000 μ g/L的储备液, 于4 ℃条件下保存, 有效期3个月。

1.3.2 样品前处理

取1 mL血液于10 mL的离心管中, 加入1 mL乙腈, 高速涡旋5 min, 10 000 r/min高速离心5 min, 取上清液过0.22 μ m有机相滤膜, 待测。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Waters公司ACQUITY UPLC HSS T3液相色谱柱; 流速：0.3 mL/min; 进样量：1 μ L; 流动相A为甲酸水（体积分数0.1%）, 流动相B为甲醇; 梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序 Table 1 Mobile phase of gradient setup

1.3.4 质谱条件

离子源：可加热电喷雾离子源（HESI）; 扫描模式：负离子模式; 采集方式：全扫描/数据依赖二级扫描（Full MS/ddMS2）; 离子传输管温度：320 ℃; 鞘气（N2）：35 arb; 辅助气（N2）：10 arb; 一级扫描分辨率：70 000; 二级扫描分辨率：17 500; 二级质谱碰撞能为归一化碰撞能(NCE)：30%、45%、60%。

2 结果与讨论
2.1 仪器条件的优化

2.1.1 色谱条件的优化

本实验对比了Waters公司ACQUITY UPLC HSST3色谱柱（2.1 mm× 50 mm× 1.8 μ m）、Thermo Syncronis C18色谱柱（2.1 mm× 100 mm× 5.0 μ m）、Thermo Accucore aQ色谱柱（2.1 mm× 150 mm× 2.6 μ m）的峰宽、响应值和在空白血中添加100 μ g/L浓度的溴敌隆标准品的回收率, 见表2, ACQUITY UPLC HSS T3、Thermo Syncronis C18色谱柱均能满足要求, 综合考虑选取ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱。

表2 不同色谱柱峰宽、响应值和回收率比较 Table 2 Comparison of peak width, response values and relative standard deviations (RSDs) among different capillary columns

对流动相进行了优化。比较了甲醇水（0.1%FA）、乙腈水（0.1%FA）和甲醇水的效果。结果表明使用甲醇水（0.1%FA）作为流动相时, 峰形、峰面积要优于乙腈水（0.1%FA）和甲醇水。使用甲醇水（0.1%FA）为流动相的溴敌隆标准溶液的提取离子色谱图见图1。

图1 溴敌隆提取离子色谱图Fig.1 Ion chromatogram of the extracted ion from bromadiolone

2.1.2 质谱条件的优化

本实验优化了归一化碰撞能, 在归一化碰撞能为30%、45%、60%时, 能够获得更丰富的二级碎片离子信息, 且[M-H]+母离子525.07184和二级碎片离子78.91930、250.06433（Δ ≤ 5 ppm）的丰度比更合适。归一化碰撞能优化见图2。

图2 归一化碰撞能为20%、30%、40%的溴敌隆质谱图(a); 归一化碰撞能为30%、45%、60%的溴敌隆质谱图(b)Fig.2 The mass spectra of bromadiolone at (20%, 30%, 40%) (a) and (30%, 45%, 60%) (b) normalized collision energy

2.1.3 基质效应的评价

电喷雾质谱分析往往会存在基质效应（ME）[7, 8], 影响方法的灵敏度、精密度和准确度。本实验采用提取后添加法对血液基质对溴敌隆的检验进行了基质效应评价, 按照公式：

ME=（1-空白基质溶液中溴敌隆的峰面积/纯溶剂中溴敌隆的峰面积）× 100%

ME=0, 表示无基质效应; ME< 0, 表示存在基质增强效应; ME> 0, 表示存在基质抑制效应。ME绝对值越大, 则基质效应越明显, 在± 20%以内, 属于弱基质效应[7]。结果表明本方法ME=-0.8%, 基质效应弱, 在实际工作定量检验中可以忽略, 见图3。

图3 溴敌隆甲醇溶液（100 μ g/L）提取离子色谱图(a); 空白血液基质内溴敌隆（100 μ g/L）提取离子色谱图（b）Fig.3 Ion chromatogram of bromadiolone (100 μ g/L) in either methanol (a) or blood(b)

2.2 线性范围和检出限

取六份空白血液各1 mL, 分别添加溴敌隆标准溶液使浓度达到10、20、50、100、200、500 μ g/L, 用1.3.2方法分别对六份添加样品前处理, 在优化的检测条件下, 以溴敌隆在质谱中的峰面积为纵坐标（y）、质量浓度为横坐标（х ）进行线性拟合, 得线性方程为y=960 713+239 935х , R2=0.997 4。最低检出限为500 ng/L, S/N> 10, 见图4。

图4 溴敌隆检出限提取离子色谱图Fig.4 Ion chromatogram of bromadiolone under the detection limit

2.3 回收率和精密度

取三份空白血液1 mL各进行3个不同浓度水平的加标回收率和精密度实验, 每个加标水平重复测定6次, 结果见表3。

表3 溴敌隆加标回收率和相对标准偏差（n=6） Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of bromadiolone spiked into blood (n=6)
3 结论

本实验建立了UPLC-HRMS检验血液中的痕量溴敌隆成分的分析方法。该方法前处理快速、简单、高效, 准确度高, 精密度好, 基质效应不明显, 能满足工作中溴敌隆中毒的快速检验检测需求, 为案件性质的分析和急、慢性中毒患者的抢救争取时间。

4 案例应用

2018年3月, 泰山区发生一起杀人后服毒自尽的案件, 现场发现印有溴敌隆标签的塑料瓶装红色液体, 本实验室利用上述方法从送检的红色液体和死者心血中均检出溴敌隆成分。

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