Agilent7890A/5975C型GC-MS, 配有电子轰击离子源（EI源）、Agilent Chemstation工作站; Agilent 7694E顶空器。Agilent 1 mL手动进样针（带锁止阀）、PoraPLOT Q毛细管柱、Agilent 20 mL顶空瓶。氧化亚氮标准气体（徐州特种气体有限公司）, 纯度> 99.99%。高纯氦气（上海BOC气体有限公司）, 纯度> 99.999%。二氯甲烷, 分析纯（上海凌峰化学试剂有限公司）。空白血液, 采集自健康人及非氧化亚氮相关的不同死因的死者。

色谱条件：Agilent PoraPLOT Q（30 m× 0.25 mm× 8 μ m）毛细管柱; 柱温程序为初始温度50 ℃, 保持1 min后, 以2 ℃/min 升至60 ℃, 40 ℃/min升至220 ℃, 保持10 min; 载气为高纯氦气, 流速为3.0 mL/min; 进样口温度200 ℃; 传输线温度200 ℃; 分流比15:1。

质谱条件：电子轰击离子源（EI）, 电子能量70 eV; 离子源温度230 ℃, 四级杆温度150 ℃, 接口温度200 ℃; 扫描模式为全扫描（SCAN）, 扫描质量数范围10~450 amu 。

取检材血液1 mL置于20 mL顶空瓶中, 加入1 μ L内标二氯甲烷, 压盖密封, 置室温下平衡10 min, 放入顶空加热器70 ℃下加热10 min, 抽取瓶中上层气体300 μ L手动进样GC-MS。

1.4.1 氧化亚氮及二氯甲烷色质谱图

将氧化亚氮标准气体充气于500 mL气体采集袋, 从气体采集袋中抽取相应体积的氧化亚氮添加于空白血液制得1 mL/mL的样品, 按1.3操作后经GC-MS分析。

1.4.2 空白对照

取10份空白血液按1.3操作后进GC-MS分析。

1.4.3 线性关系及检测限

将氧化亚氮标准气体充满500 mL气体采集袋, 抽取相应体积氧化亚氮气体添加于空白血液中, 分别制得0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mL/mL的系列样品, 按1.3处理后进样GC-MS, 每个体积浓度点2个重复样品。以氧化亚氮定量碎片离子m/z 44与二氯甲烷碎片离子m/z 49峰面积之比为自变量（x）, 以氧化亚氮的浓度（mL/mL血）为因变量（y）, 进行线性回归计算。以信噪比（S/N）=3为最低检出限（LOQ）, 以S/N=10为最低定量限（LOD）。

1.4.4 精密度及准确度

分别制得2.0、0.5、0.06 mL/mL血3个依次对应高、中、低体积浓度样品, 每个体积浓度点6个重复样品, 按1.3操作后经GC-MS分析, 以每种浓度的相对标准偏差为日内精密度。该实验连续3 d, 以每种浓度的相对标准偏差为日间精密度。分别计算每种浓度样品的氧化亚氮m/z 44峰面积与二氯甲烷m/z 49峰面积比值, 代入工作曲线计算出实际浓度, 以实测浓度与理论浓度的比值为准确度。

经标准添加样品进样后确定, 氧化亚氮相对保留时间（Rt）为8.620 min, 特征碎片离子为m/z 44、30、28等; 内标二氯甲烷相对保留时间为17.071 min, 特征碎片离子为m/z 49、28、64等（见图1）。

图1

Fig.1

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	图1 氧化亚氮及二氯甲烷色质谱图（a：色谱图; b：氧化亚氮质谱图; c：二氯甲烷质谱图）Fig.1 Mass spectrogram and chromatogram of nitrous oxide and dichloromethane (a: chromatograms of two substances; b/c: mass spectrogram of nitrous oxide/dichloromethane)

所有空白血液样品色谱图中在8.620 min均未出现氧化亚氮峰, 17.071 min内标正常出峰, 空白无干扰。

经实验, 血液中氧化亚氮在0.02~5.0 mL/mL血体积浓度内具有良好的线性关系, 线性方程为y = 2.361 3x - 0.042 3（R² = 0.999 4）, LOQ为0.005 mL/mL血, LOD为0.016 mL/mL血; 日内精密度与日间精密度均小于15%, 准确度均在（100± 15）%之内, 均在可接受范围内（见表1）。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 方法精密度及准确度 Table 1 Precision and accuracy of the method 添加浓度/（mL/mL血） 日内精密度（n=6）/% 日间精密度（n=18）/% 准确度/% 0.06 9.51 8.48 111.35 0.5 5.94 6.54 103.40 2 5.61 8.62 98.55

表1 方法精密度及准确度 Table 1 Precision and accuracy of the method

4.1.1 检材的选择

在上述两起案件中, 除血液检材外, 尸体解剖时均提取了气体检材及组织检材。气体检材抽取300 μ L进样GC-MS。组织检材因为基质各不相同, 不同组织检材中氧化亚氮的准确定量需要进一步研究。本文对组织检材的处理参照1.3步骤, 取各类组织检材2 g, 剪碎后放入顶空瓶中压盖密封, 室温下平衡10 min后, 放入顶空加热器70 ℃下加热10 min, 吸取上层空气300 μ L进样GC-MS, 对案件2中检出氧化亚氮的组织检材提取m/z 44离子并记录峰面积, 以此比较各组织检材一次顶空过程中释放出氧化亚氮的量。从表2及图2~4可以看出：案件2检材除口腔气体中未检出氧化亚氮外, 气管气体、右肺支气管气体、左肺支气管气体、胃内气体、肺血、心血、脾组织、肺组织、肾组织、脑组织、胆囊组织中、胰组织、肝组织中均检出氧化亚氮成分, 肺组织一次顶空过程释放出的氧化亚氮的量大于其他组织检材; 案件1气管内气体、口腔气体均未检出氧化亚氮, 胃内气体、肺血、肺组织、心血均检出氧化亚氮。

图2

Fig.2

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	图2 案件1提取检材检验结果Fig.2 Results tested of the samples extracted from various tissues of the victim of case 1

图3

Fig.3

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	图3 案件2提取检材检验结果Fig.3 Results tested of the samples extracted from various tissues of the victim of case 2

图4

Fig.4

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	图4 案件2组织检材中m/z 44峰面积相对大小Fig.4 Relative size of m/z 44 peak area from tissue samples of case 2

结合上述检验结果, 本文建议将肺部相关检材（肺组织, 肺支气管内空气、肺血）以及心血作为重点优先提取, 其他组织有条件地提取; 胃内气体也建议同步提取。

4.1.2 检材的提取

氧化亚氮性质稳定, 在体内仅有少部分氧化亚氮可经肠道细菌的作用进行生物氧化, 产生亚硝酸盐和氮等^[15]。因此在提取检材时应避免氧化亚氮的流失。检材提取在解剖时同步进行, 血液检材按1 mL每瓶分装在20 mL顶空瓶中, 加入内标后密封待检; 气体检材用针筒抽取后, 针头伸入顶空瓶底部缓慢注入并密封待检; 组织检材切取小块放入顶空瓶中密封保存。

氧化亚氮是大气中的痕量气体, 大气中N₂O的排放源包括自然源和人为源, 自然源包括海洋、森林、草地等, 人为源包括生物质燃烧及工业排放^[3]。对大气中氧化亚氮浓度的研究一直有很多, 经查阅资料, 氧化亚氮浓度随着环境、产业、季节、风向等因素均会有变化^{[16, 17, 18, 19, 20, 21]}, 本文曾在分流比5:1的情况下进样1 mL空气, 可检出极微量的氧化亚氮, 建议理化检验人员在开展氧化亚氮检验时应每次进行背景检测, 并根据当地实际环境情况, 采集本地空气样本, 调节分流比与进样体积, 排除背景干扰。