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徐曼曼, 赵蒙, 王朝虹, 李虹, 段正萍, 文云波. UPLC-MS/MS法检测饮料和尿液中的γ-羟基丁酸及其前体物质[J].刑事技术, 2020,45(3):246-249
XU Manman, ZHAO Meng, WANG Zhaohong, LI Hong, DUAN Zhengping, WEN Yunbo. Determination of γ-Hydroxybutyric Acid and Its Precursors in Beverage or Urine by UPLC-MS/MS[J]. Forensic Science and Technology,2020,45(3): 246-249  
doi: 10.16467/j.1008-3650.2020.03.006
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UPLC-MS/MS法检测饮料和尿液中的γ-羟基丁酸及其前体物质
徐曼曼1, 赵蒙2, 王朝虹2, 李虹3,*, 段正萍1, 文云波3
1.昆明医科大学法医学院,昆明 650500
2.最高人民检察院检察技术信息研究中心,北京 100144
3.毒品分析及禁毒技术公安部重点实验室,昆明 650228
* 通讯作者简介：李虹,女,云南个旧人,学士,主任法医师,研究方向为毒物毒品检验技术。E-mail: yngalh@163.com

第一作者简介：徐曼曼,女,山东济宁人,硕士在读,研究方向为法医毒物分析。E-mail: 229308223@qq.com

基金资助: 公安部科技强警基础工作专项项目（2018GABJC37 ）
摘要

目的 建立超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法检测饮料和尿液中的γ-羟基丁酸（4-Hydroxybutanoic acid,GHB)及其前体物质1,4-丁二醇(1,4-Butanediol, 1,4-BD)和γ-丁内酯(γ-Butyrolactone, GBL),为相关案件的侦破提供技术支持和鉴定依据。方法 以GHB-d6为内标,饮料和尿液经0.1%氨水水溶液按比例（1:99）稀释后,离心,过滤膜后,采用ACQUITY UPLC HSS T3 （2.1mm×100mm,1.8μm）色谱柱,以0.1%的氨水水溶液-甲醇为流动相进行梯度洗脱,采用电喷雾离子源（ESI）、多反应监测（MRM）正负离子模式对各化合物进行检测。结果 样品中原浓度,在2~500μg/mL范围内线性关系良好,相关系数均大于0.997,低中高3个浓度下加标回收率（R%)在86.6%~122.2%之间,相对标准偏差（RSD%）在0.7%~9.2%之间,GHB和GBL的检出限为1μg/mL,1,4-BD的检出限为2μg/mL,GHB的定量限为2μg/mL,GBL的定量限在2~3μg/mL之间,1,4-BD的定量限在3~4μg/mL之间。结论 本实验样品前处理方法简单,回收率高,精密度好,可作为饮料和尿液中γ-羟基丁酸及其前体物质的检验方法。

关键词: 法医毒物学; 超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法; γ-羟基丁酸; 1,4-丁二醇; γ-丁内酯; 饮料; 尿液
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2020)03-0246-04
Determination of γ-Hydroxybutyric Acid and Its Precursors in Beverage or Urine by UPLC-MS/MS
XU Manman1, ZHAO Meng2, WANG Zhaohong2, LI Hong3,*, DUAN Zhengping1, WEN Yunbo3
1. Institute of Forensic Medicine, Kunming Medical University, Kunming 650500, China
2. Procuratoral Technology and Information Research Center, Supreme People’s Procuratorate, Beijing 100144, China;
3. Ministry of Public Security's Key Laboratory of Narcotics Assay and Control Technology, Kunming 650228, China
Abstract

Objective To establish a method for the determination of γ-hydroxybutyric acid (GHB) and its precursors [1,4-butanediol (1,4-BD) and γ-butyrolactone (GBL)] in beverage or urine by ultra-high performance liquid chromatography coupling with the triple quadrupole tandem mass spectrometry, so as to provide technical support and appraisal basis for the detection of relevant cases.Methods With GHB-d6 as the internal standard, the sampling beverage or urine was diluted (1: 99) with 0.1% aqueous ammonia solution, afterwards centrifuged and filtered, consecutively having the resulted sample separated through an Acquity UPLC HSS T3 column (2.1mm×100mm, 1.8μm) that was eluted with ammonia water solution-methanol as the mobile phase. Each separated compound was detected with electrospray positive ionization (ESI+) and negative ionization (ESI-) in the MRM mode.Results The tested sample showed that the 3 compounds (GHB, 1,4-BD, GBL) were of good linear relationship in the range of 2-500μg/mL and the correlation coefficients of R2>0.997, with the spiked recoveries (R%) at three concentrations (low, medium, high ) being 86.6%-122.2%, the relative standard deviation (RSD%) being between 0.7% -9.2%. Besides, the detection limits of GHB and GBL were 1μg/mL, yet that of 1,4-BD was 2μg/mL. The quantitative limit of GHB was 2μg/ml, with that of GBL 2-3μg/mL and 1,4-BD’s 3-4μg/mL.Conclusions The method is of simple sample preparation, high recovery and high precision, capable of being used for the related cases to test γ-hydroxybutyric acid and its precursors in beverage or urine.

Key words: forensic toxicology; ultra-high performance liquid chromatography coupling triple quadrupole tandem mass spectrometry; γ-hydroxybutyric acid; 1,4-butanediol; γ-butyrolactone; beverage; urine

γ -羟基丁酸（4-Hydroxybutanoic acid, GHB)是一种效力强, 快速作用于中枢神经系统的抑制剂。是哺乳动物和人体内γ -氨基丁酸的代谢物, 是一种内生的生物物质, 在医学、药学领域里被认为是一种神经递质。在自我平衡调整和产生有规律的睡眠等方面起着非常重要的作用[1]。近年来, GHB及其前体物质1, 4-丁二醇( 1, 4-butanediol, 1, 4-BD)和γ -丁内酯( γ -butyrolactone, GBL) 成为了新兴的滥用药物, 由于GHB无色、无味 , 使其易于投放至饮料中难以引起受害者察觉。服用后会快速产生幻觉并昏昏欲睡, 且GHB会令受害人丧失记忆 , 而无法回忆受害过程[2], 被用作迷奸药, 与性犯罪联系在一起, 对社会造成极大危害。γ -丁内酯（GBL）和 1, 4-丁二醇（1, 4-BD）是GHB的前体药物, 通常被看作摄取后转化为GHB的相关物质, 也是哺乳动物的大脑里的内生物质[3]。GBL在酶催化作用下或是增加pH（如加入NaOH）的情况下, 很快转化为GHB, 而在人体中, 1, 4-BD 也能很快的代谢为GHB, 在国外GBL和1, 4-BD的滥用也越来越严重[4]。目前, 对于GHB的检测方法主要有气相色谱法（GC)[5]、气相色谱-串联质谱法(GC-MS)[6, 7, 8, 9]、高效液相色谱法（HPLC）[10, 11]、毛细管电泳技术[12]、超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)[13, 14, 15]、化学显色法[16]等。本实验建立了饮料和尿液中GHB、GBL和1, 4-BD同时检测的UPLC-MS/MS分析方法, 此方法简便快捷, 为相关刑侦案件侦查和鉴定提供了技术支持。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

Waters Acquity超高效液相色谱和Waters Xevo® TQ-S三重四级杆串联质谱仪（UPLC-MS/MS, 美国Waters 公司）, 振荡器Vortex Genie 2T（Scientific Industries SI 美国）, 台式超高速离心机3K15（SIGMA, 德国）, 天平XS205（METTLER TOLEDO, 瑞士）, 移液枪 eppendorf Research （500~5 000、100~1 000、0.5~10 µ L, 美国）, Transferpette（10~100 µ L, BRAND德国）, 0.2 μ m有机微孔滤膜（天津市津腾设备有限公司）。

γ - 羟基丁酸、GHB-d6甲醇标准物质溶液(浓度1 mg/mL, 美国Cerilliant公司）; γ -丁内酯甲醇标准物质溶液（纯度大于99%, 公安部物证鉴定中心）; 1, 4-丁二醇甲醇标准物质溶液（纯度98%, 德国Augsburg公司）; 甲酸、乙腈、甲醇（HPLC级, 美国Fisher Scientifc 公司）, 氢氧化铵溶液（HPLC级, 瑞士）, 超纯水（屈臣氏饮用水, 4.5 L, 广州）。

4种饮料样品（可乐、咖啡、果汁、牛奶）均购自北京某超市, 尿液样本由没有GHB摄药史的志愿者提供。

1.2 实验方法

1.2.1 混合标准溶液的配制

称取γ -丁内酯10.229 mg, 溶解于2.045 8 mL甲醇液中, 配制成5 mg/mL的单标储备液; 称取1, 4- 丁二醇10.211 mg, 溶解于2.042 2 mL甲醇液中, 配制成5 mg/mL的单标储备液; 将γ - 羟基丁酸、γ -丁内酯和1, 4- 丁二醇的单标储备液分别稀释并配制100、500 μ g/mL的混合标准储备液; 将GHB-d6配制成100 μ g/mL的单标储备液, 冷冻保存。

1.2.2 样品前处理

取10 μ L的饮料或尿液, 用0.1%的氨水水溶液稀释至1 mL, 稀释比例（1:99）, 涡旋混匀30 s, 离心(3 min, 13 500 r), 取上清液, 过0.2 μ m有机微孔滤膜后, 供UPLC-MS/MS分析。

1.2.3 仪器条件

色谱条件：Waters Acquity UPLC® HSS T3柱(2.1 mm× 100 mm, 1.8 μ m), 柱温：40℃, 样品室温：5℃。流动相条件及梯度：A相为甲醇溶液, B相为0.1%的氨水水溶液, 流速为0.3 mL/min。梯度洗脱程序：0~0.25 min, 99%B; 0.25~2.00 min, 98%B; 2.00~3.00 min, 90%B; 3.00~4.00 min, 50%B; 4.00~6.00 min, 99%B。进样量为5 μ L。

质谱条件：电喷雾离子源正离子（ESI+）、负离子（ESI-）及多反应监测模式（MRM）, 毛细管电压：3.0 kV, 离子源温度：150 ℃, 脱溶剂气温度：500 ℃, 脱溶剂气流速：800 L/h, 锥孔气流速：150 L/h, 碰撞气：氩气, 流速：0.15 mL/min。MRM参数见表1。

表1 4种化合物MRM离子对和质谱采集参数 Table 1 The MRM transitional and acquisition ion pairs of 4 compounds and relevant parameters of mass spectrum
2 结果与讨论
2.1 前处理条件选择

本实验考察了不同稀释比例（1:9、1:49和1:99）的纯水, 乙腈, 0.1%的氨水水溶液作为提取溶剂的前处理方法, 分别取空白饮料和尿液, 添加混合标准物质溶液, 用上述提取溶剂进行不同比例稀释后, 进行样品前处理, 配制成进样浓度为0.2、0.5、1 μ g/mL的加标样品, 加入GHB-d6使其进样浓度为1 μ g/mL, 平行双样, 三次进样。结果表明水, 乙腈, 0.1%的氨水水溶液稀释比例越大回收率越高, 而在同样稀释比例（1:99）的情况下, 0.1%的氨水水溶液的回收率最高, 其回收率（R%)在86.6%~122.2%之间, 相对标准偏差（RSD%）在0.7%~9.2%之间。3种化合物在0.1%的氨水水溶液、纯水和乙腈中稀释比例为1:99时的回收率见补充材料表S1。

表S1 3种化合物在不同溶剂水溶液稀释比例1:99的回收率 Table S1 Recoveries of three compounds in beverage or urine diluted (1:99) with different solvents/solutions
2.2 液相条件选择

由于流动相的选择对GHB及其2种前体物质的色谱分离和响应值有较大影响, 本实验考察0.1%氨水水溶液-乙腈, 0.1%氨水水溶液-甲醇为流动相的分离情况。发现用乙腈作为有机相GBL有杂峰出现, 出现干扰。而用甲醇作为有机相响应值较高, 峰形较好, 故选择0.1%氨水水溶液-甲醇作为液相条件。因目标化合物均为小分子化合物, 采用上述条件出现保留时间相近的情况, 但由于质谱的离子扫描模式（MRM）, 避免待测物之间的相互干扰, 因此并不影响准确定量和定性分析。

2.3 方法的线性方程、基质效应、检测限、定量限

取空白饮料和尿液, 分别加入不同浓度的混合标准物质溶液, 按照1.2.2节方法进行前处理, 使溶液进样浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μ g/mL, 加入GHB-d6, 使其进样浓度为1.0 μ g/mL。在所述条件下进行分析（n=6), GHB及其两种前体物质的质量浓度(x)与这3种化合物与GHB-d6峰面积的比值（y)呈线性关系, R2均大于0.997。取空白饮料和尿液各10 μ L, 按照1.2.2节进行前处理, 获得空白基质溶液后, 配制成进样浓度分别为0.2、0.5、1.0 μ g/mL的基质加标样品。平行双样, 三次平行测定, 基质效应（ME%）为80%~120.3%, 相对标准偏差（RSD%）为0.5%~6.6%。一般来说, 基质效应在80%~120%之间, 在实际检测中可忽略基质效应的影响。取空白饮料和尿液进行标样添加前处理, 重复实验6次, 进行检出限（LOD)和定量限(LOQ)的测定, 结果GHB和GBL的检出限为1.0 μ g/mL, 1, 4-BD的检出限为2.0 μ g/mL; GHB的定量限为2.0 μ g/mL, GBL的定量限在2.0~3.0 μ g/mL之间, 1, 4-BD的定量限在3.0~4.0 μ g/mL之间。以信噪比S/N≥ 3作为检出限, 以信噪比S/N≥ 10作为定量限。实验结果见补充材料表S2。

表S2 3种化合物线性范围、回归方程、决定系数、基质效应、检出限和定量限（n=6) Table S2 Linear range, regression equation, coefficient of determination, matrix effect (ME%, n=6), LOD and LOQ of 3 compounds in beverage or urine
2.4 方法的日内、日间精密度

配制进样浓度分别为0.2、0.5、1.0 μ g/mL的低中高3个浓度的基质加标样品, 平行双样, 6次平行测定, 一天进样2次, 连续5 d, 进行日内、日间稳定性及精密度测试, 以相对标准偏差（RSD%）考察方法的精密度。结果日内精密度在0.7%~9.6 %之间, 日间精密度在0.2%~8.6 %之间, 表明目标化合物在基质中有较好的稳定性（见补充材料表S3）。

表S3 各化合物的日内、日间精密度（n=6） Table S3 Intra- and inter-day precisions of 3 compounds in beverage or urine (n=6)
2.5 实际样品测试

将可乐、果汁、咖啡、牛奶和尿液按照1.2.2节进行前处理, 各2份, 平行3次进样, 均未检出目标化合物。

3 结论

本实验采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法检测不同类型饮料和尿液中的γ -羟基丁酸、γ -丁内酯和1, 4-丁二醇, 该方法前处理操作简便快捷, 回收率高, 在灵敏度和精密度上均满足检测要求, 为相关物质案件侦查提供技术支持和鉴定依据。

补充材料

本文补充材料文件详见：http://www.xsjs-cifs.com/CN/volumn/home.shtml。

参考文献
[1] 孟品佳. γ-羟基丁酸分析研究综述[J]. 中国人民公安大学学报(自然科学版), 2008(2): 11-17.
(MENG Pinjia. Review on the analysis of GHB[J]. Journal of Chinese people’s Public Security University (Science and Technology), 2008(2): 11-17. ) [本文引用:1]
[2] 郑永志. γ—羟基丁酸的滥用现况及检验方法[C]//中国法医学会. 中国法医学最新科研与实践(二)——全国第七次法医学术交流会论文精选. 中国法医学会, 2004: 2.
(ZHENG Yongzhi. Abuse of γ-hydroxybutyric acid and its test method[C]//. Forensic Medicine Association of China. The latest research and practice of forensic science in China (II) - Selected papers of the 7th national forensic academic exchange. Forensic Medicine Association of China, 2004: 2. ) [本文引用:1]
[3] KANKAANPÄÄ A, LIUKKONER R, ARINIEMI K. Determination of g-hydroxybutyrate (GHB) and its precursors in blood and urine samples: A salting-out approach[J]. Forensic Science International, 2007, 170: 133-138. [本文引用:1]
[4] WOOD M, LALOUP M, SAMYN N, et al. Simultaneous analysis of gamma-hydroxybutyric acid and its precursors in urine us-ing liquid chromatography-tand em mass spectrometry[J]. Joural of Chromatography A, 2004, 1056: 83-89. [本文引用:1]
[5] 孟品佳. γ-羟基丁酸的五氟卞基溴衍生化气相色谱/质谱分析[J]. 分析化学, 2008, 36(1): 61-65.
(MENG Pinjia. Analysis of gamma-hydroxybutyric acid using gas chromatography/mass spectrometry after pentafluorobenzyl derivatization[J]. Chinese Journal Analytical Chemistry, 2008, 36(1): 61-65. ) [本文引用:1]
[6] 梁丽军, 薛锦锋, 田琳琳. 气相色谱-三重四极杆串联质谱法测定液体检材中的γ-羟基丁酸[J]. 刑事技术, 2019, 44(2): 136-139.
(LIANG Lijun, XUE Jinfeng, TIAN Linlin. Determination of γ-GHB in liquid sample by GC/MS-MS[J]. Forensic Science and Technology, 2019, 44(2): 136-139. ) [本文引用:1]
[7] 刘缙, 杨洪国, 蔡红新. 气质联用法快速分析“咔哇潮饮”中γ-羟基丁酸[J]. 中国法医学杂志, 2018, 33(3): 291-293.
(LIU Jin, YANG Hongguo, CAI Hongxin. Determination of GHB in a beverage which named “kawachaoyin” by GC /MS[J]. Chinese Joural of Forensic Medicine, 2018, 33(3): 291-293. ) [本文引用:1]
[8] 张绍雨. 尿和血中γ-羟基丁酸(GHB)的GC-MS-SIM测定[C]//. 中国法医学会. 全国第七次法医学术交流会论文摘要集. 中国法医学会, 2004: 1.
(ZHANG Shaoyu. Determination of GHB in urine and blood by GC-MS-SIM[C]//Forensic Medicine Association of China. Abstracts of papers of the 7th national forensic academic exchange. Forensic Medicine Association of China, 2004: 1. ) [本文引用:1]
[9] 张绍雨, 林云珠, 柯洪伟. GC-MS法测定尿中γ-羟基丁酸[J]. 分析仪器, 2005(2): 24-27.
(ZHANG Shaoyu, LIN Yunzhu, KE Hongwei. Determination of γ-hydroxybutyric acid in urine by GC-MS[J]. Analytic Instruments, 2005(2): 24-27. ) [本文引用:1]
[10] 陈学国, 马生祥, 马玄中. 衍生化-液相色谱-紫外检测联用测定尿中γ-羟基丁酸[J]. 福建分析测试, 2014, 23(2): 20-22.
(CHEN Xueguo, MA Shengxiang, MA Xuanzhong. Determination of gamma-hydroxybutyric acid in human urine with pre-column derivatization by high performance liquid chromatography-ultraviolet detection[J]. Fujian Analysis and Testing, 2014, 23(2): 20-22. ) [本文引用:1]
[11] 张雪华, 王静静, 王猛. 分子氧氧化四氢呋喃产物中γ-丁内酯、4-羟基丁酸与1, 4-丁二酸的反相高效液相色谱法测定[J]. 分析测试学报, 2013, 32(10): 1232-1236.
(ZHANG Xuehua, WANG Jingjing, WANG Meng. RP-HPLC determination of ester and organic acids in the oxidative products of tetrahydrofuran with molecular oxygen[J]. Journal of Instrumental Analysis, 2013, 32(10): 1232-1236. ) [本文引用:1]
[12] 潘爱华, 盖连磊, 马贤慧. 毛细管电泳高频电导法检测饮料中γ-羟基丁酸[J]. 中国法医学杂志, 2010, 25(2): 91-93.
(PAN Aihua, GAI Lianlei, MA Xianhui. Rapid determination of GHB in beverages by capillary electrophoresis with high frequency conductivity detection[J]. Chinese Journal of Forensic Medicine, 2010, 25(2): 91-93. ) [本文引用:1]
[13] 陈月猛, 钱振华. 超高效液相色谱-串级质谱法测定“咔哇潮饮”和“咔哇氿”中γ-羟基丁酸和γ-丁内酯[J]. 中国药物依赖性杂志, 2019, 28(3): 201-208.
(CHEN Yuemeng, QIAN Zhenhua. Detection of γ-hydroxybutyric acid and γ-butyrolactone in “making wow drinks” and “making wow gui” by ultra performance liquid chromatography -tand em mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Drug Dependence, 2019, 28(3): 201-208. ) [本文引用:1]
[14] 刘嘉飞, 王立亚, 曾雪芳. 超高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定饮料中的γ-羟基丁酸和γ-丁内酯[J]. 食品安全质量检测学报, 2018, 9(12): 2970-2974.
(LIU Jiafei, WANG Liya, ZENG Xuefang. Determination of γ-hydroxybutyric acid and γ-butyrolactone in beverages by ultra performance liquid chromatography-tand em mass spectrometry[J]. Journal of Food Safety and Quality, 2018, 9(12): 2970-2974. ) [本文引用:1]
[15] 张浩杰, 王蔚昕, 夏学明. 超高效液相色谱-质谱联用法测定饮料中γ-羟基丁酸及其前体物质γ-丁内酯和1, 4-丁二醇[J]. 分析试验室, 2015, 34(1): 72-76.
(ZHANG Haojie, WANG Weixin, XIA Xueming. Determination of γ-hydroxybutyrate and its precursor substances, γ-butyrolactone, 1, 4-butanediol in beverages via ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Analysis Laboratory, 2015, 34(1): 72-76. ) [本文引用:1]
[16] 张绍雨, 黄增萍. 化学显色法快速筛选饮料及尿液中γ-羟基丁酸和γ-丁内酯[J]. 法医学杂志, 2006, 22(6): 424-427, 482.
(ZHANG Shaoyu, HUANG Zengping. A color test for rapid screening of gamma-hydroxybutyric acid (GHB) and gamma-butyrolactone (GBL) in drink and urine[J]. Journal of Forensic Medicine, 2006, 22(6): 424-427, 482. ) [本文引用:1]