引用本文
林汉光, 董建国, 钟思婷, 唐剑频. 引物结合区点突变致D18S51等位基因丢失[J]. 刑事技术, 2020, 45(2): 201-203。
LIN Hanguang, DONG Jianguo, ZHONG Siting, TANG Jianpin. Allelic Dropout of D18S51 from Single Nucleotide Mutation in the Primer Zone[J]. Forensic Science and Technology, 2020, 45(2): 201-203.  
Permissions
Copyright©2020, 《刑事技术》编辑部
《刑事技术》编辑部
引物结合区点突变致D18S51等位基因丢失
林汉光1, 董建国2, 钟思婷1, 唐剑频1,*
1.广东医科大学法医学系,广东 东莞523808
2.上海市美吉司法鉴定所,上海201200
* 通讯作者简介：唐剑频,男,广西桂林人,博士,副教授,研究方向为法医物证学教学科研和司法鉴定。E-mail:tangjianpin@gdmu.edu.cn

第一作者简介：林汉光,男,广东德庆人,学士,主检法医师,研究方向为法医学教学科研和司法鉴定。E-mail:langzi070@163.com

收稿日期:2018-05-28 网络出版日期:2020-04-15
基金项目:广东医学院科研基金面上培育项目（M2013015）
摘要

目的 确定D18S51基因座是否存在等位基因缺失及其原因。方法 应用多个STR试剂盒检测检材以确定D18S51基因座的等位基因缺失情况;重新设计引物对所测D18S51基因座进行单独扩增,并对缺失的等位基因进行测序。结果 该案例被检个体的D18S51侧翼序列引物结合区发生突变,致等位基因丢失。结论 亲权鉴定时出现不符合孟德尔遗传规律现象,应使用多个试剂盒检测验证以避免父权误判。

关键词: 短串联重复多态性; 等位基因丢失; 突变
中图分类号:DF795.2 文献标志码:B 文章编号:1008-3650(2020)02-0201-03
Allelic Dropout of D18S51 from Single Nucleotide Mutation in the Primer Zone
LIN Hanguang1, DONG Jianguo2, ZHONG Siting1, TANG Jianpin1,*
1. Department of Forensic Medicine, Guangdong Medical University, Dongguan 523808, Guangdong, China
2. Shanghai Meiji Firm of Judicial Identification, Shanghai 201200, China
Abstract

Objective To ascertain the allelic dropout of D18S51 locus.Methods The samples, found of allelic dropout in D18S51 locus, were genotyped by different STR kits so that the allele 19 was targeted to have it sequenced.Results A mutation was observed from single one nucleotide in the primer zone at the flanking region of allele 19 within D18S51 locus.Conclusions The different STR kits should be used to genotype the samples for parentage test in order to avoid misjudging patriarchy when paternity testing reveals inconformity to the Mendel’s law of segregation.

Keyword: short tandem repeats (STR); allelic dropout; mutation

个体识别和亲权鉴定普遍使用短串联重复多态性（STR）商品化试剂盒。如果STR侧翼引物结合区序列发生了突变, 致使引物结合效率下降, 就可能导致出现等位基因丢失现象而影响亲子鉴定的结果判断。本文报道一例应用Microreader21(Direct)ID身份鉴定试剂盒, 因样本D18S51基因座侧翼引物结合序列突变导致等位基因丢失现象发生的案例。

1 案例资料
1.1 样本及检验方法

被鉴定人某男要求鉴定其与女儿是否存在亲权关系。取该男及其女儿的外周血样本并分别编为A1、A2。用Chelex-100法提取样本的基因组DNA, 用Microreader21(Direct)ID系统（苏州阅微基因技术有限公司）分析并测定样本, 以STRtyper-21G扩增荧光检测试剂盒（海尔施基因科技有限公司）、PowerPlex21系统（Promega公司）复测。

1.2 检验结果

样本A1、A2的D18S51基因座的基因型分别为16-16、22-22（见图1）, 不符合真正父女的遗传关系, 但其余19个STR基因座均符合遗传规律, 20个STR的累积亲权指数为0.081 3。

因为仅有一个基因座不符合孟德尔遗传规律, 故加用其它STR分型试剂盒检测样本。用STRtyper21G扩增荧光检测试剂盒检验A1、A2样本, 发现D18S51基因座A1样本的基因型为16-19, A2的基因型为19-22（见图2）; 用PowerPlex21系统（Promega公司）检测的分型结果与STRtyper21G试剂盒的分型结果也相一致（见图3）。所有试剂盒STR分型均重复检测三次, 结果相同。

图1 Microreader21(Direct)ID系统的D18S51分型图谱Fig.1 The genotyping profiles of D18S51 from Microreader21(Direct)ID kit (A1 and A2 representing the samples from father and daughter, respectively)

图2 STRtyper21G扩增荧光检测试剂盒的D18S51分型图谱Fig.2 The genotyping profiles of D18S51 from STRtyper21G kit (A1 and A2 representing the samples from father and daughter, respectively)

图3 PowerPlex21系统的D18S51分型图谱Fig.3 The genotyping profiles of D18S51 from PowerPlex 21 kit (A1 and A2 representing the samples from father and daughter, respectively)

在Microreader21(Direct)ID系统D18S51引物的外侧[1], 重新设计D18S51的引物：正向CACGTGCCCTGTAGTCTCAGC、反向TGGTCTTGACCAGAAGAAATCC, 再扩增样本A1、A2。扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳, 以EZ-Resin PCR产物纯化试剂盒（上海博彩生物科技有限公司）分离获取两样本等位基因19 的DNA片段, DNA片段经分子克隆, 用质粒通用引物进行双向测序, 结果（见图4）显示两样本在Microreader21(Direct)ID系统D18S51等位基因19的前引物结合区DNA序列（5’ -TTCTTGAACCCAGAAGGTTA-3’ ）与GenBank数据库参考序列和Microreader21(Direct)ID系统引物序列（5’ -TTCTTGAGCCCAGAAGGTTA-3’ ）不一致, 检索GenBank、Hapmap数据库此处及周围序列未发现SNP; 而上述参考序列引物结合区3’ 端第13个碱基为G, 而样本测序结果显示该处碱基为A, 说明样本在该处发生了点突变。

图4 D18S51等位基因19测序结果（A、B分别为样本等位基因19引物结合区的正向、反向测序结果）Fig.4 The results of DNA sequencing from the allele 19 in D18S51 (A and B representing the forward and reverse sequencing results of primer-binding zone from the samples’ allele 19)

2 讨论

本案例根据Microreader21(Direct)ID系统的20个STR基因座分型结果, 仅D18S51基因座不符合遗传规律, 推测该基因座可能发生了基因突变, 按照《GA/T965-2011法庭科学DNA亲子鉴定规范》及本单位常用遗传学数据, 计算被检父的累积父权指数（CPI）为0.081 331 227; 依据法医亲子鉴定标准, 该被检父CPI大于0.000 1而小于10 000, 无法肯定或否定父权关系[2]。但仅有D18S51基因座不符合孟德尔遗传规律, 如果是突变, 由等位基因16突变为22, 发生了6步突变, 该类突变的概率极低, 且20个基因座仅有一个基因座异常, 推测更可能是发生了等位基因丢失; 经其它STR分型试剂盒检测样本, 确认仅是Microreader21(Direct)ID系统导致等位基因丢失现象发生。根据检测结果分析推测, 可能是父亲侧翼序列引物结合区发生了突变并传递给孩子, 导致父亲和孩子的D18S51等位基因19以Microreader21(Direct)ID系统检测出现丢失现象。亲子鉴定中单一基因座不符合孟德尔遗传规律, 且假定父（母）亲与孩子的等位基因相差多个重复单位, 应使用其他试剂盒检测确认是重复区突变导致了不符合遗传规律, 还是引物结合区突变使等位基因丢失了, 以确保鉴定结果的准确与可靠。

近年有关STR基因座等位基因丢失现象[3, 4, 5, 6, 7, 8]屡有文献报道, 但有些没有检测突变碱基的位置。本案例为确认侧翼序列突变位置, 对丢失的等位基因进行了测序; 结果显示Microreader21试剂盒D18S51基因座前引物结合区3’ 端第13个碱基G突变为A。根据PCR原理, 一般情况下引物3’ 端前3个碱基影响延伸; 如果引物结合区3’ 端的碱基发生突变, 即便引物与模版DNA引物结合区结合, 扩增过程中延伸效率也会降低甚或不发生延伸。本案例引物结合区的点突变发生在3’ 端的第13个碱基（G突变为A）, 导致引物结合区Tm值发生改变; 经引物设计软件计算, 突变后的Tm值降低到54.9 ℃, 而Microreader21(Direct)ID系统的退火温度为60 ℃, 致使D18S51的前引物不能完全有效结合目标DNA。因此, Microreader21(Direct)ID试剂盒D18S51的引物在复合体系中的效率降低, 是导致突变发生后出现等位基因丢失现象的最主要原因。3’ 端第13个碱基的突变可不必避开（3’ 端前5个碱基以外即可）, 但引物本身的结合效率必须得到提升。检案中如果怀疑有等位基因丢失, 应更换新的试剂盒进行验证; 确认存在等位基因丢失时, 还应对丢失的等位基因进行测序, 以了解具体的突变位置（比如本文案例引物结合区的侧翼）, 以便为STR分型试剂盒引物设计时避开易突变区域提供参考。

参考文献
[1] YANG M, YIN C, LV Y, et al. Development of a rapid 21-plex autosomal STR typing system for forensic applications[J]. Electrophoresis, 2016, 37(21): 2789-2799. [本文引用:1]
[2] 侯一平, 法医物证学[M]. 4版. 北京: 人民卫生出版社, 2016: 184-191.
(HOU Yiping. Forensic biology[M]. 4th ed. Beijing: People’s Medical Publishing House, 2016: 184-191. ) [本文引用:1]
[3] 季安全, 赵鑫, 李继周, 等. Profiler Plus系统在法医学DNA检验中的问题探讨[J]. 刑事技术, 2000(6): 10-12.
(JI Anquan, ZHAO Xin, LI Jizhou, et al. Perplexities of the Profiler Plus application in forensic medicine[J]. Forensic Science and Technology, 2000 (6): 10-12. ) [本文引用:1]
[4] 任文彦, 郝宏蕾, 王怀锋, 等. GlobalFilerTM试剂盒在尸骨鉴定中的应用[J]. 刑事技术, 2015, 40(5): 379-381.
(REN Wenyan, HAO Honglei, WANG Huaifeng, et al. Identification of unknown corpses using GlobalFiler™ kit[J]. Forensic Science and Technology, 2015, 40(5): 379-381. ) [本文引用:1]
[5] 谢素梅, 张贵芹, 李学博. 亲子鉴定中D18S51基因座等位基因丢失一例之原因分析[J]. 医学与法学, 2014, 6(1): 89-90.
(XIE Sumei, ZHANG Guiqin, LI Xuebo. Cause analysis on D18S51 loci allelic loss in a case of a paternity test[J]. Medicine and Law, 2014, 6(1): 89-90. ) [本文引用:1]
[6] 穆立伟, 赵智超, 杨金龙. D18S51基因座等位基因丢失3例[J]. 中国法医学杂志, 2016, 31(5): 504-506.
(MU Liwei, ZHAO Zhichao, YANG Jinlong. Three cases of allelic loss from D18S51 locus[J]. Chinese Journal of Forensic Medicine, 2016, 31(5): 504-506. ) [本文引用:1]
[7] 刘翠兰, 梁江江, 朱传红, 等. D8S1179基因座等位基因“丢失”1例[J]. 刑事技术, 2008(6): 57-58.
(LIU Cuilan, LIANG Jiangjiang, ZHU Chuanhong, et al. A case of allelic loss from D18S51 locus[J]. Forensic Science and Technology, 2008(6): 57-58. ) [本文引用:1]
[8] CLAYTONA T M, HILLA S M, DENTON L A, et al. Primer binding site mutations affecting the typing of STR loci contained within the AmpFlSTR® SGM Plus™ kit[J]. Forensic Science International, 2004, 139(2-3): 255-259. [本文引用:1]