1993年, Lee等^[2]首次在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans, C.elegans）体内发现一个长度为22 nt的RNA小分子lin-4, 其能在翻译水平抑制核蛋白lin-14的表达, 从而参与调节线虫幼虫的发育过程。2000年, Reinhart等^[3]在C. elegans体内发现另一个长度为21 nt的RNA小分子let-7, 其具有转录后调节功能, 调控C. elegans由第一幼虫阶段过渡到第二幼虫阶段。lin-4和let-7 RNA基因是非同源的, 但却均是一组蛋白质编码靶基因的3’ 非翻译区序列的互补成分, 这些靶基因通常受到RNA的负调节, 由于lin-4和let-7都具有控制发育阶段的功能, 因此也被称为时序性小RNA（small temporal RNAs, stRNA）。在随后不到一年的时间里, 研究人员在其他真核生物如果蝇、蠕虫和人体细胞当中发现了超过100个（其中果蝇中发现约20个, 蠕虫中约有60个, 人体细胞中约有30个）这类可转录的非编码小RNA分子, 并将其命名为miRNA^{[4, 5, 6]}。Sanger研究所建立的miRBase数据库（http://www.mirbase.org/）是储存miRNA信息最主要的公共数据库之一, 可为研究者提供包括已发表的miRNA序列数据、注释、预测基因靶标等信息。目前该数据库已更新至最新版本V22.0, 包含有271个物种的38 589个成熟的miRNA序列, 其中人类基因组编码的miRNA前体达到1 881个, 成熟miRNA达2 588个。但该数据库用于miRNA信息查询较多, 靶关系预测还较少。

成熟的miRNA是一类长度约为21~25 nt的单链小分子, 通常5’ 端带有一个磷酸基团, 3’ 端为羟基端。3’ 端有1~2个碱基长度变化, 5’ 端第一个碱基对U有强烈的倾向性, 而对G有抗性。成熟的miRNA与上游或下游的序列不完全配对从而可形成茎环结构。从初级转录大分子RNA到成熟的单链miRNA至少需要三个步骤^{[7, 8]}：1）miRNA基因由RNA聚合酶II/III转录生成初级转录产物pri-miRNA; 在微处理复合物Drosha-DGCR8的作用下, pri-miRNA被剪切成约70 bp、具有茎环结构的前体miRNA (pre-miRNA); 2）Ran-GTP依赖性核浆转运子Exportin5将剪切好的pre-miRNA转运至细胞质; 3）胞质中的pre-miRNA在RNase III Dicer的作用下被剪切成22 nt左右的二聚体RNA。该二聚体RNA（即miRNA/miRNA* ）由miRNA以及长度与其相似、但不完全互补配对的茎-环结构的对侧臂 miRNA* 组成。二聚体RNA与含有Argonaute蛋白的装载复合体结合, 在解螺旋酶（helicase）作用下, miRNA* 从二聚体中解离并被降解, 成熟miRNA与复合体整合成RNA介导的沉默复合体（RNA-inducing silencing complex, RISC）, 如图1所示。

图1

Fig.1

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	图1 成熟miRNA的生物合成过程示意图Fig.1 Schematic of the physiological and biochemical process for miRNA to mature

随着越来越多的miRNA被发现, miRNA的命名及标准也经历了一些变化。最早发现的几个miRNA基因根据其功能被发现者分别命名为lin-4、let-7、lsy-6。2003年Ambros等^[9]科学家联合发表一篇miRNA鉴定、注释及命名规则的文章。此后几年时间, Griffiths-Jones等^{[10, 11, 12]}对miRNA的命名规则又进行了补充。当前, 以miRBase数据库为基础, 研究者建立了包括动植物、病毒miRNA前体及成熟体的完整命名体系。以动物miRNA为例, miRNA成熟体命名遵循如下几点：1）在确定命名规则之前发现的miRNA保留其原名字; 2）miRNA成熟体简写成miR, 根据其物种名称（hsa、mmu、rno分别代表人、小鼠、大鼠）及被发现的先后顺序加上阿拉伯数字, 如hsa-miR-122, 一般情况下, 数字越小代表发现越早; 3）高度同源的miRNA在数字后加一个英文小写字母（a、b、c）以示区别; 4）由不同染色体上的DNA序列转录加工而成的具有相同成熟体序列的miRNA, 则在后面加上阿拉伯数字以示区分, 如hsa-miR-199a-1/hsa-miR-199a-2; 5）通常一个miRNA前体长度约70~80 nt, 很可能两个臂分别产生了成熟miRNA, 在之前的规则中, 表达水平较高的miRNA尾部不加任何符号, 表达水平低的miRNA尾部加* 号。在miRBase19.0中, miR* 命名终止使用, 取而代之的是“ -5p” 和“ -3p” 命名, 代表从前体的5’ 端臂和3’ 端臂加工而来（如图2所示）。

图2

Fig.2

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	图2 基于miRBase命名规则的microRNA命名体系示意图（图片来源https://www.jianshu.com/p/5feb4740075a）Fig.2 Schematic for nomenclature of microRNA based on the miRBase nominating rules

大量研究表明, miRNA通过负调节信使RNA（messenger RNA, mRNA）广泛参与个体发育、细胞分化、增殖以及凋亡等生理过程和肿瘤的发生发展、心脏病、糖尿病等病理过程^{[13, 14]}。其主要通过两条途径调节基因表达：一是miRNA介导RISC识别特异的靶mRNA的3’ 非翻译区, 然后直接剪切mRNA和/或抑制其编码蛋白的翻译, 从而抑制转录后基因水平的表达。RISC的作用方式取决于miRNA与mRNA互补程度, 若两者间互补配对程度高, 则RISC将对mRNA进行直接剪切; 若两者间互补配对程度不高, 则需通过抑制mRNA蛋白翻译过程。当mRNA降解后, miRNA保持完整并继续指导RISC对其他特异的靶mRNA发挥剪切作用。二是通过调节DNA甲基转移酶表达, 维持细胞中DNA甲基化或改变组蛋白修饰等多种途径而调节基因表达^[15]。研究表明, miRNA既是DNA甲基化转移酶（DNA methylation transferase, DNMT）的效应器又是其调节靶标, miRNA结合DNA甲基化转移酶mRNA的3’ -UTR并抑制其表达, 从而影响全基因组的甲基化模式, 该机制在机体的许多疾病发生发展中发挥作用。

基因芯片（gene chip）, 又称微阵列芯片技术（microarray）、生物芯片或DNA芯片技术, 该技术指在一块芯片上固定大量的与miRNA序列互补的探针, 然后经与标记的样本RNA杂交, 通过检测每个探针分子的杂交信号强度而获取样品分子的数量和序列信息。该方法能实现高通量研究miRNA表达, 短时间内同时检测大量miRNA的表达丰度, 是快速检测全基因组内特异性miRNA表达丰度的优先选择。但该方法对RNA的纯度质量要求较高, 在纯化过程会丢失掉许多小分子RNA, 影响低丰度RNA的检测, 虽然信息量大却质量低, 因此常伴有假阳性结果, 故通常用于前期目标分子的筛选^[30]。

下一代测序（next generation sequencing, NGS）平台的出现为miRNA的检测提供了新方法。转录组测序技术（RNA sequencing, RNA-seq）是一种新兴的以基因测序为基础的高通量测序（High-throughput sequencing）方法。该方法首先从总RNA中分离纯化20~30 nt的miRNA, 分别在miRNA的5’ 端和3’ 端连上接头序列, 经逆转录得到70~80 bp的DNA片段, 制备成测序文库; 然后通过对文库中数以万计的克隆群组（colony）进行延伸反应, 检测对应的信号; 最终再对产生的阵列图像进行时序分析, 获取序列信息。该方法最主要的优势在于能够对已知和未知的miRNA进行检测, 并且可以精确读取miRNA序列信息。Goodwin等^[31]曾对高通量测序技术原理以及各平台的优势和实践应用做过细致比较分析。最有代表性的平台有：Illumina的基因组分析仪、Roche454基因组测序仪以及AB Life Technologies的SOLiD系统。针对miRNA具有序列较短的特征, Illumina的基因组分析仪和SOLiD系统更为适用。其中, Illumina的基因组分析仪具有对样品需求量少, 数据误差小, 操作简便等优势。SOLiD系统测序通量大于20 GB/次, 读长可达50碱基（随机片段测序）和2× 50个碱基（末端配对测序）, 单次运行所得的数据量最大、准确度最高。而Roche 454基因组测序仪读长为400~500 nt, 远大于miRNA的序列长度（22 nt）, 因此该测序仪适用于对新物种的基因组测序和转录组测序, 极少用于miRNA测序。2013年, 该平台下GS FLX+和GS Junior的测序仪器因成本及应用范围限制等原因而停产。在短读长高通量测序平台中, 454平台和Ion Torrent平台的优势在于读长较长, 分别约为700和400 bp, 其中, Ion Torrent平台通量从50 Mb到15 Gb, 运行时间从2~7 h不等, 是目前测序平台中最快的一个, 在转录组与可变剪切鉴定中具有很大优势。在单分子高通量测序平台中, 最常用的是PacBio Biosciences的单分子实时测序法, 但该方法在miRNA测序中未得到广泛应用。

实时荧光定量PCR技术（Realtime PCR, qRT-PCR）具有高灵敏度的优势^[32], 是目前实验室常用的RNA定量检测方法。该方法在反应体系中加入荧光基团, 通过荧光信号累积可实时检测整个PCR进程, 在扩增的指数期连续检测荧光信号强弱变化而能即时测定特异性产物的量, 从而可对起始模板进行定量分析。与mRNA相比, 成熟miRNA序列较短, 又没有poly(A)尾, 故不能按常规方法设计随机引物进行逆转录和PCR扩增。采用qRT-PCR技术对miRNA进行定量检测常用的方法是利用茎-环状引物反转录miRNA, 即stem-loop RT-qPCR检测法^[33], 该方法需要在反转录引物中设计一段与miRNA互补的特异性序列和一段共有序列, 与靶miRNA退火反转录可得到一个较长的反转录扩增子（cDNA）, 共有序列提供了一个通用引物结合位点, 接着通过一个与miRNA序列特异的引物和一个通用引物进行PCR扩增。该方法特异性高, 样品消耗量少, 能检测出低丰度表达的目标miRNA。