引用本文
孙会会, 袁明俊, 杜鸿雁, 胡琨, 仲建军. 超快速液相色谱-串联质谱法测定人血中的氯苯那敏[J]. 刑事技术, 2020, 45(1): 55-59。
SUN Huihui, YUAN Mingjun, DU Hongyan, HU Kun, ZHONG Jianjun. Determination of Chlorpheniramine in Human Plasma by Ultra Fast Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry[J]. Forensic Science and Technology, 2020, 45(1): 55-59.  
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超快速液相色谱-串联质谱法测定人血中的氯苯那敏
孙会会1, 袁明俊1, 杜鸿雁2, 胡琨1, 仲建军1
1. 德州市公安局物证鉴定研究中心, 山东 德州 253000
2. 公安部物证鉴定中心,北京 100038

第一作者简介：孙会会,女,山东临沂人,硕士,助理工程师,研究方向为毒物毒品检验。E-mail:shqcome@163.com

收稿日期:2018-03-01 网络出版日期:2020-02-15
摘要

目的 建立超快速液相色谱-串联质谱方法（LC-MS/MS）对人体血液中氯苯那敏成分进行定性定量分析。方法 血液经过乙腈沉淀蛋白后,振荡、离心,过0.22μm有机微孔滤膜,上清液经LC-MS/MS分析。选取Agilent ZORBAX Eclipse C18作为液相色谱柱,柱温为40℃,以5mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸水溶液-乙腈作为流动相,流速1.2mL/min,进行梯度洗脱,采用多反应监测模式,通过氯苯那敏的保留时间和两对离子对进行定性,外标-标准曲线法进行定量分析。结果 该方法测定血液中氯苯那敏成分在0.1~100ng/mL浓度范围内具有良好线性,相关系数达到0.998 5。方法最低检出限(LOD S/N=3)达0.03ng/mL,定量限(LOQ S/N=10)为0.1ng/mL,日内精密度在5%以下,日间精密度在8%以下,重现性好,回收率高。结论 该方法快速、准确、可靠,能够适用于血液中氯苯那敏的分析。

关键词: 氯苯那敏; 液相色谱-串联质谱; 血液
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2020)01-0055-05
Determination of Chlorpheniramine in Human Plasma by Ultra Fast Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
SUN Huihui1, YUAN Mingjun1, DU Hongyan2, HU Kun1, ZHONG Jianjun1
1. Material Evidence Authentication and Research Center of Dezhou Public Security Bureau, Dezhou 253000, Shandong, China
2. Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing 100038, China
Abstract

Objective A method by ultra fast liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UFLC-MS/MS) was to develop and validate for detecting and determining chlorpheniramine in human plasma.Methods The plasma samples were precipitated with acetonitrile, afterwards oscillated and centrifugalized. The supernatant was filtered by 0.22μm organic micro-pore membrane, then detected by LC-MS/MS. The anlyte was separated from a reversed-phase C18 column (Agilent ZORBAX Eclipse C18) by a gradient elution, with the column oven being at 40°C. The mobile phase of elution was consisted of 5mmol/L ammonium formate-0.1% methanoic acid-acetonitrile at a flow rate of 1.2mL/min. Retention time and two ion pairs of chlorpheniramine were used for qualitative analysis in multiple reaction monitoring mode (MRM). The quantitative detection for chlorpheniramine was based on calibration curve.Results By the optimized LC-MS/MS method, the correlation coefficient of chlorpheniramine was 0.9985 within the linear range of 0.1ng/mL~100ng/mL. The limit of detection (LOD S/N=3) was 0.03ng/mL for the chlorpheniramine in plasma samples, with its limit of quantification (LOQ S/N=10) being 0.1ng/mL. In addition, the intra- and inter-day relative standard deviations (RSDs) were respectively less than 5% and 8%, showing a good reproducibility and high recovery.Conclusions The method developed with this research is rapid, highly accurate and reliable for analysis of chlorpheniramine in human plasma.

Keyword: chlorpheniramine; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; plasma samples

氯苯那敏(chlorpheniramine, CP), 分子式是C16H19ClN2, 分子量是274.12, CAS号是132-22-9。该物质是一种组织胺受体阻断药物, 作为组织胺H1受体拮抗剂, 可以对抗机体过敏反应所引起的毛细管扩张, 将毛细管的通透性降低, 减少鼻涕、鼻塞、打喷嚏等, 缓解由于支气管平滑肌的收缩而引起的喘息。该药物抗组胺作用持续时间较长, 能够增强麻醉药、镇痛药、催眠药和局麻药的药效。在临床的实践中常用氯苯那敏马来酸盐, 治疗感冒导致的头痛、发烧、咽喉疼等[1], 但是该药物能够产生一定程度上的中枢抑制等副作用, 严重者则会引起心跳加快[2], 所以服用该药品时, 要遵从说明书, 如果与驾驶有关的人员不恰当地服用, 或许会导致重大的交通事故。因此, 建立一种快速、准确的测定人体血液中氯苯那敏的检验方法意义重大。

对于氯苯那敏的检验方法, 相关文献的报道主要有液相色谱法（LC）[3, 4, 5, 6, 7]、液相色谱-串联质谱法（LC-MS）[8, 9, 10, 11, 12, 13, 14]、电化学法[15]等。本文在此基础上采用了岛津LC-20AD超快速液相色谱仪与AB Sciex 3200Q Trap三重四级杆-离子阱串联质谱仪联用, 利用多反应监测模式（multiple reaction monitoring, MRM）, 血液前处理采用乙腈沉淀蛋白法, 采用外标-标准曲线法进行定量, 氯苯那敏的两对离子对进行定性, 对人体血液中氯苯那敏成分进行测定。方法前处理步骤简单, 分析时间短, 重现性良好, 有较好的回收率, 适宜公安部门办案的需要。

1 材料与方法
1.1 仪器

岛津LC-20AD超快速液相色谱仪（日本Shimadzu公司）; AB Sciex 3200 Q Trap三重四级杆-离子阱串联质谱仪（美国AB公司）; 移液器（德国艾本德股份有限公司）; VORTEX-GENIE2 涡轮振荡器（美国Scientific Industries）; TGL-16C 离心机（上海安亭科学仪器厂）; 0.22 μ m有机微孔滤膜（上海富达医用塑料有限公司）; BSA-323S 型电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）。

1.2 试剂

甲醇、乙腈（色谱纯, 美国 Fisher公司）; 甲酸、甲酸铵（色谱纯, 天津科密欧化学试剂有限公司）; 马来酸氯苯那敏标准品（上海安普实验科技股份有限公司）。

1.3 样品前处理

取0.5 mL检材血液置于5 mL试管中, 将1.5 mL的乙腈加入后振荡, 然后以8000 r/min 的速度离心10 min, 取出上层液体, 过0.22 μ m有机微孔滤膜, 将过滤后液体放于进样小瓶中, 供UFLC-MS/MS分析。

1.4 色谱条件

Agilent ZORBAX Eclipse C18(4.6 mm× 150 mm, 5.0 μ m)液相色谱柱, 柱温40 ℃, 进样量1 μ L, 5 mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸水溶液（A相）-乙腈（B相）作为流动相, 流速1.2 mL/min, 程序设定为梯度洗脱, 见表1。

表1 梯度洗脱条件 Table 1 Conditions for gradient elution
1.5 质谱条件

AB Sciex 3200Q Trap三重四级杆-离子阱串联质谱仪, 采用电喷雾离子化模式(electrospray ionization, ESI+), 检测方法采用多反应监测模式(MRM), 离子化电压(IS)：+5500 V, 碰撞活化参数(CAD):Medium; 气帘气(CUR)：35 psi, 喷雾气(Gas1)：65 psi, 辅助加热气(Gas2)：65 psi, 离子源温度(TEM):650 ℃, 接口加热(ihe)：On。根据以上条件优化质谱参数, 氯苯那敏的质谱条件见表2。

表2 氯苯那敏的质谱参数 Table 2 MS /MS parameters of chlorpheniramine
2 结果与讨论
2.1 色谱条件的优化

实验中比较了甲醇和乙腈作为有机相时, 氯苯那敏在色谱柱上的分离效果, 结果表明乙腈比甲醇有更好的分离效果, 峰形也较好, 且样品前处理采用乙腈作为沉淀剂, 所以实验中选择乙腈作为有机相。本文分别考察了去离子水(A)-乙腈(B)、0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈 (B)、5 mmol/L甲酸铵(A)-乙腈 (B)以及5 mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)作为流动相时的梯度洗脱效果, 通过比较出峰时间、分离效果、峰形和灵敏度, 实验结果显示在相同的梯度洗脱条件下, 5 mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸水溶液(A )-乙腈(B)作为流动相时, 洗脱效果更好。方法采用5 mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)作为流动相, 以有机相初始浓度20%并持续1 min后, 分别以10%、20%、30%的梯度陡度设定梯度洗脱程序, 实验结果如表3所示。

表3 不同条件下峰参数 Table 3 Peak parameters under various conditions

结果表明, 在相同的有机相初始浓度下, 随着梯度陡度的增加, 氯苯那敏在该色谱柱上的响应提高, 保留时间变短, 峰宽变窄。实验中选择以20%为有机相的初始浓度, 以30%的梯度陡度进行梯度洗脱程序, 同时参考本实验中仪器的最大承受压力, 考虑到分析时间, 流动相采用1.2 mL/min的流速。通过上述条件, 氯苯那敏在该色谱柱上的保留时间为3.26 min, 见图1。

图1 氯苯那敏MRM色谱图Fig.1 MRM chromatogram of chlorpheniramine

2.2 质谱条件的选择

配制100 ng/mL的氯苯那敏的标准溶液, 采用ESI+模式, 针泵直接进样分析, 对该物质的质谱条件进行优化。通过一级全扫描质谱逐渐改变去簇电压（declustering potential, DP）, 得到氯苯那敏的母离子质量数[M+H]+为m/z 275.2; 在氯苯那敏的母离子被确定的基础上, Production MS2得到二级质谱, 通过逐渐改变离子对的碰撞电压（collision energy, CE）, 选择质荷比较大、强度较稳定的m/z 167.2、m/z 230.2两个碎片作为子离子, 组成定性离子对275.2/167.2和275.2/230.2; 在MRM模式下, 进一步优化这两对离子对的去簇电压DP和碰撞电压CE, 由于主要的碎片m/z 230.2的响应强度较强且背景干扰小, 所以选择275.2/230.2作为定量离子对。

2.3 方法学考察

2.3.1 方法的专属性

分别取6个不同来源的空白血样置于试管中, 按照“ 1.3 样品前处理” 进行操作, 得到空白血样的MRM色谱图。将一定浓度的氯苯那敏的溶液加入空白血样中, 依照前处理方法进行处理, 得到血液中添加标准药物的MRM色谱图, 如图2。结果表明, 空白血样中在氯苯那敏出峰时间没有色谱峰出现, 空白血添加标准品后在氯苯那敏的出峰时间有色谱峰出现, 两对离子对m/z 275.2/167.2和275.2/230.2均出现, 且峰形较好, 所选择的离子相对丰度比符合要求, 说明采用该方法检测血液氯苯那敏成分时, 人体的内源性物质对于氯苯那敏的检测没有干扰, 该方法有较好的专属性。

图2 空白血中添加氯苯那敏MRM色谱图Fig.2 MRM chromatogram of blank plasma spiked with chlorpheniramine

2.3.2 工作曲线和检出限

选取275.2> 230.2作为氯苯那敏的定量离子对。取9份空白血样各0.5 mL, 依次添加不同浓度的氯苯那敏标准溶液, 配制成浓度为0.1、0.5、1、5、10、20、50、80、100 ng/mL的溶液, 按照1.3方法进行处理, 在选定的色谱和质谱条件下进行定量分析。以氯苯那敏的峰面积(y)为纵坐标, 溶液浓度(x, ng/mL)为横坐标进行线性回归, 得到线性方程为y=652x+833(r=0.9985)。结果表明：血液中氯苯那敏在0.1~100 ng/mL浓度范围内具有良好的线性, 线性范围较宽。以信噪比S/N=3, 该方法对血液中氯苯那敏的最低检出限(limit of detection, LOD)是0.03 ng/mL; 以信噪比S/N=10时, 该方法对血液中氯苯那敏的定量限(limit of quantification, LOQ)是0.1 ng/mL。

2.3.3 回收率和精密度

取空白血液0.5 mL, 依次加入氯苯那敏溶液, 配制成1、50、100 ng/mL的样品溶液, 按照1.3的方法进行前处理, 每种浓度在优化后的质谱和色谱条件下平行分析3次, 求取添加中目标样品的峰面积和相同浓度对照品的峰面积的比值, 测定回收率。取空白血液0.5 mL, 依次加入氯苯那敏溶液, 配制成1、50、100 ng/mL的样品溶液, 对每种浓度有三组平行样, 按照1.3的方法进行前处理, 在选定的条件下, 在同一天内不同时间进行分析, 记录每个样本峰面积并计算相对标准偏差, 求得日内精密度; 连续三日, 记录每个样本峰面积并计算相对标准偏差, 求得日间精密度。结果见表3。

表3 血液中氯苯那敏的回收率及精密度 Table 3 Recovery and precision of chlorpheniramine in human plasma
2.4 案例应用

2017年9月, 代某驾驶小型普通客车（载乘隋某）驶入西侧水沟中, 隋某死亡。民警送检隋某的血液, 要求进行检验。经分析, 死者血液中未检出乙醇成分; 经苯二氮卓类药物LC-MS/MS筛查方法, 检出阿普唑仑成分, 含量为183.6 ng/mL; 经GC/MS分析未检出氯苯那敏成分, 利用本文建立的LC-MS/MS方法检出死者血液中含有氯苯那敏成分, 含量为34.4 ng/mL。

3 结论

氯苯那敏作为临床使用的第一代抗组胺类药物, 一般镇静作用较弱, 但是该药物与催眠类药物如阿普唑仑同时使用时, 具有药物协同作用, 可增加中枢神经的抑制作用。在上述案例中, 血液中阿普唑仑的含量超过了治疗量, 而氯苯那敏可增加阿普唑仑的药效。

本文建立了一种LC-MS/MS对人体血液中氯苯那敏成分进行定性定量分析的方法, 样品前处理简单。传统的液-液萃取法使用有机溶剂量多, 影响身体健康, 提取操作麻烦; 固相萃取法进行样品前处理时, 需要对萃取柱进行活化, 且成本较高。本文采用的前处理是采用乙腈沉淀蛋白的方法, 提取的效率高, 对样品不用进行衍生化处理, 操作简单, 采用多反应监测模式, 选取氯苯那敏的两对离子对进行定性分析, 提高了检测的专一性和灵敏度, 定性定量准确, 方法专属性较强, 生物样品中内源性物质对该分析方法干扰少。利用外标-标准曲线法进行定量分析, 血液中氯苯那敏的浓度在0.1 ~100 ng/mL范围内具有良好线性, 线性范围较宽, 相关系数达到0.998 5。方法最低检出限(LOD)达0.03 ng/mL, 定量限(LOQ)为0.1 ng/mL, 日内精密度在5%以下, 日间精密度在8%以下, 回收率在86%以上, 可以满足公安部门实际办案中的需要。

参考文献
[1] 曹玉明. 高效液相色谱法测定小儿氨酚黄那敏颗粒中马来酸氯苯那敏含量及均匀度[J]. 安徽医药, 2016, 20(8): 1486-1489.
(CAO Yuming. Determination of the content and uniformity of dosage units in pediatric paracetamol, artificial cow-bezoar and chlorphenamine maleate granules by HPLC[J]. Anhui Medical and Pharmaceutical Journal, 2016, 20(8): 1486-1489. ) [本文引用:1]
[2] 刘杰彦, 雷双燕, 涂小玲, 等. HPLC法测定复方氨酚烷胺胶囊中氯苯那敏的含量[J]. 中国现代药物应用, 2012, 6(15): 123-124.
(LIU Jieyan, LEI Shuangyan, TU Xiaoling, et al. Determination of the content of chlorphenamine in compound paracetamol and amantadine hydrochloride capsules by HPLC[J]. Chinese Journal of Modern Drug Application, 2012, 6(15): 123-124. ) [本文引用:1]
[3] 崔颖, 吕凌, 戴萍萍, 等. 反相高效液相色谱法同时测定新复方感冒片中5 种成分的含量[J]. 中国新药与临床杂志, 2009, 28(1): 48-50.
(CUI Ying, LÜ Ling, DAI Pingping, et al. Determination of five ingredients in new compound rheum tablets by RP-HPLC[J]. Chinese Journal of New Drug and Clinical Remedies, 2009, 28(1): 48-50. ) [本文引用:1]
[4] 翁水旺. 高效液相色谱法测定酚麻美敏口腔崩解片中对乙酰氨基酚、氢溴酸右美沙芬、盐酸伪麻黄碱和马来酸氯苯那敏4组分的含量[J]. 中国药学杂志, 2007, 42(9): 695-698.
(WENG Shuiwang. Determination of four ingredients of paracetamol, pseudoephedrine hydrochloride, dextromethorphan hydrobromide and chlorphenamine maleate in oral disintegrating tablets by HPLC[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2007, 42(9): 695-698. ) [本文引用:1]
[5] YIN C H, TANG C, WU X Y, et al. HPLC determination of aminophylline, methoxyphenamine hydrochloride, noscapine and chlorphenamine maleate in compound dosage forms with an aqueous-organic mobile phase[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2003, 33(1): 39-43. [本文引用:1]
[6] JAIN V, SHARMA M C. Validated RP-HPLC method for determining the levels of bromhexine HCl, chlorpheniramine maleate, dextromethorphan HBr and guaiphenesin in their pharmaceutical dosage forms[J]. Journal of Taibah University for Science, 2016, 10(1): 38-45. [本文引用:1]
[7] DEWANI A P, BARIK B B, CHIPADE V D, et al. RP-HPLC-DAD method for the determination of phenylepherine, paracetamol, caffeine and chlorpheniramine in bulk and marketed formulation[J]. Arabian Journal of Chemistry, 2014, 7(5): 811-816. [本文引用:1]
[8] 邵华, 刘有平, 王鑫, 等. 液相色谱-大气压化学电离-串联质谱法同时测定人血浆中氯苯那敏和咖啡因的含量[J]. 沈阳药科大学学报, 2009, 26(5): 388-392.
(SHAO Hua, LIU Youping, WANG Xin, et al. Simultaneous determination of chlorpheniramine and caffeine concentrations in human plasma by liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-tand em mass spectrometry[J]. Journal of Shenyang Pharmaceutical University, 2009, 26(5): 388-392. ) [本文引用:1]
[9] 徐晓峰, 陈珺, 杭太俊, 等. LC-MS/MS法研究氨酚烷胺胶囊的人体药动学[J]. 质谱学报, 2007, 28(增刊): 74-76.
(XU Xiaofeng, CHEN Jun, HANG Taijun, et al. Pharmacokinetics study of compound paracetamol and amantadine capsules in Chinese healthy volunteers by LC-MS/MS[J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2007, 28(sup 1): 74-76. ) [本文引用:1]
[10] LOU H G, YUAN H, RUAN Z R, et al. Simultaneous determination of paracetamol, pseudoephedrine, dextrophan and chlorpheniramine in human plasma by liquid chromatography-tand em mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, 2010, 878(7-8): 682-688. [本文引用:1]
[11] 戴晓健, 陈笑艳, 张勇, 等. 液相色谱-串联质谱法同时测定人血浆中金刚烷胺和氯苯那敏[J]. 药物分析杂志, 2006, 26(6): 713-717.
(DAI Xiaojian, CHEN Xiaoyan, ZHANG Yong, et al. Simultaneous determination of amantadine and chlorpheniramine in human plasma by liquid chromatography-tand em mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2006, 26(6): 713-717. ) [本文引用:1]
[12] TAKAGAKI T, MATSUDA M, MIZUKI Y, et al. Simple and sensitive method for the determination of chlorpheniramine maleate in human plasma using liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, 2002, 776(2): 169-176. [本文引用:1]
[13] 粟燕, 陈振玲. 超高效液相色谱-串联质谱法测定人血浆中氯苯那敏[J]. 分析科学学报, 2015, 31(6): 839-842.
(SU Yan, CHEN Zhenling. Determination of chlortrimeton in human plasma with ultra performance liquid chromatography tand em mass spectrometry[J]. Journal of Analytical Science, 2015, 31(6): 839-842. ) [本文引用:1]
[14] HU Z Y, ZOU Q G, TIAN J X, et al. Simultaneous determination of codeine, ephedrine, guaiphenesin and chlorpheniramine in beagle dog plasma using high performance liquid chromatography coupled with tand em mass spectrometric detection: Application to a bioequivalence study[J]. Journal of Chromatography B, 2011, 879(32): 3937-3942. [本文引用:1]
[15] MOHAMMED A H, EMAD A K, SALIM A H, et al. A solid-state electrochemiluminescence composite modified electrode based on Ru(bpy)32+/PAHNSA: characterization and pharmaceutical applications[J]. Electrochimica Acta, 2015, 176: 179-187. [本文引用:1]