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刘帅, 赵蒙, 杨发震, 李绍鹏, 王朝虹, 李虹. UPLC-MS/MS快速筛查尿样中61种毒品及滥用药物[J]. 刑事技术, 2020, 45(1): 45-50。
LIU Shuai, ZHAO Meng, YANG Fazhen, LI Shaopeng, WANG Zhaohong, LI Hong. Rapid and Simultaneous Quantification of 61 Abused Drugs in Urine by UPLC-MS/MS[J]. Forensic Science and Technology, 2020, 45(1): 45-50.  
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《刑事技术》编辑部
UPLC-MS/MS快速筛查尿样中61种毒品及滥用药物
刘帅1, 赵蒙2, 杨发震3, 李绍鹏3, 王朝虹2, 李虹4,*
1. 昆明医科大学法医学院,昆明 650500
2. 最高人民检察院检察技术信息研究中心,北京 100040
3. 玉溪市公安局,云南 玉溪 653100
4. 毒品分析及禁毒技术公安部重点实验室,昆明 650228
* 通讯作者简介：李虹,女,云南个旧人,学士,主任法医师,研究方向为毒物毒品检验技术。E-mail：yngalh@163.com

第一作者简介：刘帅,男,山西运城人,硕士研究生,研究方向为法医毒物分析。E-mail：935385871@qq.com

收稿日期:2018-02-26 网络出版日期:2020-02-15
基金项目:公安部科技强警基础工作专项项目（2016GABJC50）
摘要

目的 建立了一种快速检测尿样中61种毒品及滥用药物的超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）方法。方法 尿样按19（体积比）经甲醇沉淀蛋白、离心处理,采用电喷雾离子源正离子（ESI+）模式和多反应检测（MRM）模式进行质谱分析。结果 61种化合物在0.1~10ng/mL浓度范围内均获得良好的线性,相关系数均在0.99以上,该方法的提取回收率分布在90.14%~129.72%之间,最小检测限可达0.05ng/mL。结论 本方法灵敏、简便、快速,适用于尿样中毒品及滥用药物的定性定量分析。

关键词: 法医毒物分析; 滥用药物; 超高效液相色谱-串联四级杆质谱; 尿样
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2020)01-0045-06
Rapid and Simultaneous Quantification of 61 Abused Drugs in Urine by UPLC-MS/MS
LIU Shuai1, ZHAO Meng2, YANG Fazhen3, LI Shaopeng3, WANG Zhaohong2, LI Hong4,*
1. Institute of Forensic Medicine, Kunming Medical University, Kunming 650500, China
2. Center of Procuratoral Technology and Information, Supreme People’s Procuratorate, Beijing 100144, China
3. Yuxi Public Security Bureau, Yuxi 653100, Yunnan, China
4. Key Laboratory of Narcotics Assay and Control Technology, Ministry of Public Security, Kunming 650228, China
Abstract

Objective A rapid and sensitive method of ultra-performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS/MS) was to develop for simultaneous determination of 61 abused drugs in urine.Methods Urine sample was precipitated with methanol under the ratio of 1:9 (V:V), afterwards centrifuged at 8500r/min for 10 min, with the supernatant being analyzed through UPLC-MS/MS in coalescence of an electrospray ionization (ESI) source. The samples were measured in the mode of electrospray positive ionization (ESI+) and multiple reaction monitoring (MRM).Results The 61 drugs were linear in the range of 0.1~10ng/mL, with their coefficients higher than 0.99. The extraction recoveries ranged from 90.14%~129.72% for all of the analytes, and their limits of detection (LODs) were 0.05 ng/mL.Conclusions The method presented here is validated to be simple, rapid, sensitive and accurate for determination of trace drugs and metabolites in urine samples.

Keyword: forensic toxicological analysis; drugs of abuse; UPLC-MS/MS; urine

毒品是指能使人形成瘾癖的药物, 如鸦片类、苯丙胺类、麦司卡林, 常被分为麻醉药品和精神药品。安眠镇静类药物也是一类作用中枢神经系统的药物, 主要表现为中枢神经系统的抑制, 产生镇静催眠、抗肌肉松弛等效果, 常引起药物滥用。因具有用量少、见效快、能产生短暂的记忆缺失、代谢快等特点, 常被用于药物辅助性犯罪[1, 2, 3]。滥用药物为代表的麻醉犯罪中生物检材的提取以尿样最为广泛也最为重要[2]。所提物证中滥用药物含量低是导致麻醉犯罪药物检测结果阴性的主要原因, 因此, 建立生物样品中滥用药物的痕量快筛方法十分必要。目前, 常用的提取净化方法主要有液-液萃取法和固相萃取法, 检测方法有气相色谱法（GC）[4, 5]、气相色谱-质谱法（GC-MS）[6, 7, 8]、高效液相色谱法（HPLC ）[9, 10]、超高效液相色谱-质谱法（ UPLC-MS）[11, 12, 13, 14], 鉴于UPLC-MS具有前处理简单（较GC）、检测周期短（较GC-MS）、定性准确（较HPLC）特点, 因此本文比较不同的尿样前处理, 建立快速、有效的超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）检测方法。

1 材料与方法
1.1 仪器

超高效液相色谱串联四级杆质谱联用仪 WATERS Xevo TQ-S（WATERS, 美国）, 振荡器 Vortex Genie 2T （Scientific Industries SI 美国）, 台式高速离心机 Heraeus Biofuge Primo Centrifuge（Thermo scientific, 美国）, 天平XS205（METTLER TOLEDO, 瑞士）, 移液枪 eppendorf Research （500~5 000 uL、100~1 000 uL、0.5~10 uL, 美国）, Transferpette 10~100 uL（BRAND 德国）, HLB萃取柱1 cc(30 mg, Oasis 爱尔兰)。

1.2 试剂

甲酸铵 (HPLC, 德国Fluka 公司); 甲酸、乙腈、甲醇（Optima LC/MS, 美国Fisher Scientifc 公司）; 超纯水（屈臣氏饮用水, 400 mL, 广州）。

1.3 标准样品

海洛因、吗啡、O3-单乙酰吗啡、O6-单乙酰吗啡、氢可酮、氧可酮、氢吗啡酮、氧吗啡酮、蒂巴因、可卡因、苯甲酰爱康宁、美沙酮、2-亚乙基-1, 5-二甲基-3, 3-二苯基氮杂戊环（EDDP）、可待因、6-乙酰可待因、二氢可待因、二氢埃托啡、丁丙诺啡、去甲基丁丙诺啡、芬太尼、哌替啶、咖啡因、非那西汀、苯丙胺、甲基苯丙胺、3, 4-亚甲二氧基甲基苯丙胺（MDMA）、3, 4-亚甲二氧基苯丙胺（MDA）、3, 4-亚甲二氧基乙基苯丙胺（MDEA）、N-甲基-3, 4-亚甲双氧基苯-2-丁胺（MBDB）、副甲氧基甲基苯丙胺（PMMA）、麻黄碱、甲基麻黄碱、甲卡西酮、氯胺酮、去甲氯胺酮、苯环己哌啶、麦司卡林、麦角酸二乙基酰胺（LSD）, 公安部物证鉴定中心;

地西泮、硝西冸、溴西泮、氟西冸、氯硝西泮、氟硝西泮、奥沙西泮、普拉西泮、替马西泮、7-氨基硝基西冸、7-氨基氟硝西冸、三唑仑、阿普唑仑、咪达唑仑、艾司唑仑、佐匹克隆、酒石酸吡唑坦、扎来普隆、安眠酮、芬氟拉明, 中国食品药品检定研究院;

α -羟基三唑仑, 5 mg; α -羟基阿普唑仑、α -羟基咪达唑仑, 100 ug/mL（甲醇液）。均购自美国SIGMA ALDRICH公司。

1.4 标准液的配制

1.4.1 标准储备液

分别准确称取适量海洛因、吗啡、O3-单乙酰吗啡、O6-单乙酰吗啡、氢可酮、氧可酮、氢吗啡酮、氧吗啡酮、蒂巴因、可卡因、苯甲酰爱康宁、美沙酮、EDDP、可待因、6-乙酰可待因、二氢可待因、二氢埃托啡、丁丙诺啡、去甲基丁丙诺啡、芬太尼、哌替啶、咖啡因、非那西汀标准物质, 用甲醇溶解, 配制成1.0 mg/mL传统毒品类储备溶液。

分别准确称取适量苯丙胺、甲基苯丙胺、MDMA、MDA、MDEA、MBDB、PMMA、麻黄碱、甲基麻黄碱、甲卡西酮、氯胺酮、去甲氯胺酮、苯环己哌啶、麦司卡林、LSD标准物质, 用甲醇溶解, 配制成1.0 mg/mL合成毒品类储备溶液。

分别准确称取适量地西泮、硝西冸、溴西泮、氟西冸、氯硝西泮、氟硝西泮、奥沙西泮、普拉西泮、替马西泮、7-氨基硝基西冸、7-氨基氟硝西冸、三唑仑、阿普唑仑、咪达唑仑、艾司唑仑、芬氟拉明、安眠酮、佐匹克隆、酒石酸吡唑坦、扎来普隆、α -羟基三唑仑标准物质, 用甲醇溶解, 配制成1.0 mg/mL镇静催眠类储备溶液。配成的标准储备液应在温度低于-20 ℃冰箱中保存, 6个月有效。

1.4.2 标准工作溶液

分别吸取适量的传统毒品类储备溶液、合成毒品类储备溶液、镇静催眠类储备溶液、α -羟基阿普唑仑、α -羟基咪达唑仑标准液, 用甲醇配制成1 μ g/mL混合标准工作溶液。此溶液应在温度低于4 ℃冰箱中保存, 1个月有效。测定样品使用时, 用甲醇将混合标准工作溶液配制成不同浓度的混合标准工作溶液。

1.5 尿液样品

空白尿液采自健康志愿者, 装入洁净容器内、密封, 注明标记, 于-20 ℃冷冻存放。

1.6 液相色谱-质谱分析条件

1.6.1 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）, 正离子多反应监测（MRM）模式; 毛细管电压：3 kV; 去溶剂气温度：500 ℃ ; 去溶剂气流速：800 L/h; 碰撞气流速：0.25 mL/min; 61种毒品及滥用药物的质谱采集参数和保留时间见表1。

表1 61种毒品及滥用药物的质谱参数和保留时间 Table 1 Monitored ions, cone voltages, collision energies and retention time of 61 abused drugs

1.6.2 色谱条件

色谱柱： ACQUITY UPLC® HSS C18色谱柱(2.1 mm× 150 mm , 1.8 μ m ); 流动相：A为乙腈+0.1%甲酸, B为5 mM甲酸铵（pH3）水溶液, 梯度洗脱条件见表2; 柱温：50 ℃; 流速：0.4 mL/min; 进样量： 5 μ L; 运行时间15 min。

表2 梯度洗脱程序 Table 2 Conditions for gradient elution
1.7 尿样前处理

1.7.1 直接稀释法

精密吸取50 μ L尿样置于离心管中, 加入450 μ L超纯水, 涡旋振荡30 s, 在8500 r/min转速下离心10 min, 取上清液供UPLC-MS/MS分析。

1.7.2 蛋白沉淀法

1）精密吸取50 μ L尿样置于离心管中, 加入450 μ L甲醇, 涡旋振荡30 s, 在8500 r/min转速下离心10 min, 取上清液供UPLC-MS/MS分析。

2）精密吸取50 μ L尿样置于离心管中, 加入450 μ L乙腈, 涡旋振荡30 s, 在8500 r/min转速下离心10 min, 取上清液供UPLC-MS/MS分析。

1.7.3 固相萃取法

精密吸取1 mL尿液置于离心管中, 在8500 r/min转速下离心10 min, 取上清液过HLB固相萃取柱（分别用1 mL甲醇和1 mL水活化、平衡）, 用1 mL 5%甲醇水溶液(体积分数)淋洗, 用1 mL甲醇洗脱, 接收洗脱液供UPLC-MS/MS分析。

2 结果与讨论
2.1 专属性验证

对空白尿样、混合标准液、尿样添加进行UPLC-MS/MS检测分析, 以各目标物两对离子对和保留时间进行定性分析, 并与已知混标进行比对, 空白尿样背景无干扰, 尿样添加MRM色谱图同混合标准液, 进样结果表明：UPLC-MS/MS检测方法专属性好。

2.2 线性及检出限

在空白尿样中添加不同浓度的61种毒品及滥用药物的对照品溶液, 浓度分别为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 ng/mL, 按照1.7项的尿样前处理方法提取, 按1.6项的条件下进行测定, 尿样中61种毒品及滥用药物在0.1~10.0、0.5~10.0 ng/mL浓度范围内线性关系良好。取线性最低点溶液逐倍稀释, 检出限以S/N> 3为评价标准, 检测限均为0.05 ng/m。

2.3 提取回收率、基质效应和精密度

配制低、中、高3个浓度的质控样品（n=6）, 按1.7项的方法处理样品, 在1.6项的条件下进行测定, 记录峰面积As; 同时, 取空白尿样, 按1.7项的方法处理后, 配制成低、中、高3个浓度的溶液（n=6）, 在1.6项的条件下进行测定, 记录峰面积Am; 另取上述3个浓度的对照品溶液, 直接在1.6项的条件下进行测定, 记录峰面积为Astd。以As/Am计算提取回收率, Am/Astd计算基质效应。用连续6次所测的质控样品浓度计算日内精密度, 见表3。

表3 61种毒品及滥用药物回收率、基质效应、日内精密度结果概述 Table 3 The extraction recoveries, matrix effects, intra-day precisions of 61 abused drugs
2.4 小结

2.4.1 回收率

低浓度组经超纯水处理后各目标物的回收率波动幅度大, 而乙腈、甲醇、HLB的回收率集中在100%, 整体趋势比较：甲醇> 乙腈> HLB> 超纯水; 海洛因为代表的传统毒品类的前处理比较：甲醇> 乙腈> HLB> 超纯水; 苯丙胺类为代表的合成毒品的前处理比较：超纯水> 甲醇> HLB> 乙腈; 镇静催眠类药物的前处理比较：甲醇> HLB> 乙腈> 超纯水。中浓度组经HLB前处理的回收率整体集中在100%, 海洛因为代表的传统毒品类的前处理比较：HLB> 甲醇> 乙腈> 超纯水; 苯丙胺类为代表的合成毒品的前处理比较：超纯水> HLB> 甲醇> 乙腈; 镇静催眠类药物的前处理比较：甲醇=HLB> 乙腈> 超纯水。高浓度组经HLB、甲醇前处理的回收率整体集中在100%~120%, 以HLB处理组最佳, 海洛因为代表的传统毒品类的前处理比较：HLB=甲醇=乙腈> 超纯水; 苯丙胺类为代表的合成毒品的前处理比较：超纯水=HLB> 甲醇> 乙腈; 镇静催眠类药物的前处理比较：HLB> 甲醇> 乙腈> 超纯水。综上可知, 经HLB前处理的回收率效果最佳, 甲醇次之; 苯丙胺类为代表的新型毒品的前处理以超纯水最佳。

2.4.2 基质效应

该尿样基质对传统、合成毒品目标物整体呈现抑制状态, 对镇静催眠类药物可抑制也可增强, 以基质效应100%为观测指标, 不同前处理对基质效应影响程度为：乙腈> HLB> 超纯水=甲醇。

2.4.3 日内精密度

甲醇处理组的日内精密度整体趋势接近0轴线, 数据变异最小。综合考虑, 甲醇处理效果较佳。

2.5 讨论分析

2.5.1 异常值

1）异常值确定

笔者认为, 只要低、中、高浓度组各个对应回收率实测值即As的真值在线性范围内, 那么该回收率是有效的。以甲醇处理组为例, 该组线性范围0.1~10 ng/mL, 0.5 ng/mLα -羟基阿普唑仑的回收率为20%, 那么其实测真值为0.5× 20%=0.1 ng/mL, α -羟基阿普唑仑回收率的理论值为20%~100%。考虑该实验的回收率上限均在100%以上, 参照残留分析方法标准规定的回收率范围在80%~120%, 将回收率高于120%的值定为该实验回收率的异常值。日内精密度高于15%为异常值。

2）异常值分析

对低、中、高三个浓度组的回收率进行纵向比较, 超纯水、乙腈、甲醇及HLB处理组的异常值表现在低、中浓度组但不局限于某类药物。首先, 数据处理方式不同。定量结果需要通过Grubbs方程或双样相对相差比较或线性回归对平行测定数据进行可疑值判别。As、Am、Astd是平行操作6次所得的均值, As组的实测值经线性回归进行筛选, Am组、Astd组未经处理, 在实验中尚未建立对应的线性。换言之, As组是外标曲线法, Am组、Astd组是外标单点法。其次, 除个别值外, 不同前处理组的日内精密度均在15%以内, 而且高浓度组的RSD值最小, 故考虑低、中浓度组较大的波动也是产生回收率异常值的原因之一。超纯水处理组的回收率不超过120%也提示待测目标物在水相中的溶解度大于有机相, 故Am组中的浓度低于As组。对于RSD高于15%的异常值, 考虑为As组的实测值经线性回归进行筛选的结果, 虽然均值在线性范围, 但实测值偏差较大。

2.5.2 基质效应

由共流出组分中的非挥发性基质影响电喷雾接口的离子化率所致, 表现为离子增强或抑制。对低、中、高三个浓度组的回收率进行纵向比较, 吗啡及其代谢产物的离子抑制最为明显, 可认为是尿样基质影响的结果; 未提供吗啡提取所需特定的pH条件也可能促进了离子抑制。其次, 药物与药物之间的电荷竞争、表面竞争也是造成离子抑制的原因。对于基质增强的药物而言, 则考虑可能是电离竞争中基质对其增强或其他药物竞争力偏下的结果。可通过建立Am组、Astd组的标准线性法和柱后注射法进行验证。

2.6 结论

本文建立了经甲醇前处理、同时检测尿中61种毒品及滥用药物的UPLC-MS/MS法, 具有快捷、有效、回收率高等特点, 适合涉及滥用药物痕量检测案件的快速筛查。

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