引用本文
牛勇, 孙文平, 卢延旭. 海洛因中毒闪电死亡的动物模型建立及超微结构观察研究[J].刑事技术, 2019,44(5):429-432
NIU Yong, SUN Wenping, LU Yanxu. Animal Model of Mouse Perished of Lightning-like Death from Heroin Poisoning under Observation into Ultrastructure of Nervous System[J]. Forensic Science and Technology,2019,44(5): 429-432  
Doi: 10.16467/j.1008-3650.2019.05.011
Permissions
Copyright©2019, 《刑事技术》编辑部
《刑事技术》编辑部
海洛因中毒闪电死亡的动物模型建立及超微结构观察研究
牛勇1, 孙文平2, 卢延旭3,*
1. 公安部刑事侦查局,北京 100741
2.山东第一医科大学,山东 泰安 271000
3. 中国刑事警察学院法医系,沈阳110038
* 通讯作者简介：卢延旭,男,辽宁沈阳人,教授,研究方向为法医毒理学。E-mail:yanxulu4689@sina.com

第一作者简介：牛勇,男,山东泰安人,博士,副主任法医师,研究方向为刑事技术。E-mail:niuyong770204@163.com

基金资助: 国家“十五”重点科技攻关课题（No. 2001BA801B04）
摘要

目的 研究海洛因中毒致小鼠闪电式死亡（lightning-like death, LLD）动物模型的建立方法,观察小鼠死亡后脑组织的病理形态学改变。方法 采用小鼠侧脑室注射（intracerebroventricle injection, icv）和尾静脉注射（tail intraveinous injection, tiv）两种方式,探讨海洛因中毒致小鼠闪电式死亡的剂量水平,采用光学显微镜和电子显微镜观察小鼠死亡后脑组织的病理形态学特征。结果 100μL盐酸海洛因（heroin hydrochloride,HRH） 尾静脉注射的LC50和LC100分别为（4.30±0.41）mg/mL和（11.83±3.13）mg/mL;icv（40μL）HRH的LC50和LC100分别为（3.83±0.69）mg/mL和（9.68±3.10）mg/mL;tiv HRH小鼠呼吸与心跳停止时间分别为（0.95±0.25）min和（7.04±0.40）min;icv HRH小鼠呼吸与心跳停止时间分别为（0.58±0.17）min和（6.68±0.61）min。普通光镜下观察可见脑组织血管淤血、水肿等组织形态学改变;透射电镜下可观察到神经细胞间隙增宽;线粒体、内质网及溶酶体等出现病理改变。结论 海洛因急性中毒致闪电式死亡可以引起神经系统组织形态病理改变。

关键词: 海洛因; 闪电式死亡; 组织形态; 超微结构
中图分类号:DF795.1 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2019)05-0429-04
Animal Model of Mouse Perished of Lightning-like Death from Heroin Poisoning under Observation into Ultrastructure of Nervous System
NIU Yong1, SUN Wenping2, LU Yanxu3,*
1. Criminal Investigation Bureau of Ministry of Public Security, Beijing 100741, China
2. Shandong First Medical University, Taian 27100, Shandong, China
3. Department of Forensic Medicine, China Criminal Police College, Shenyang 110038, China
Abstract

Objective To establish a mouse model of lightning-like death (LLD) from injecting heroin hydrochloride (HRH) and investigate the pathomorphological changes of brain tissue after death.Methods Both the tail intravenous (tiv) and intracerebroventricular (icv) injections were adopted to bring the trial mice into lightning-like death from the explored lethal quantity of heroin. The pathomorphological changes of mouse’s brain tissue were observed under microscope and transmissible electronic microscope.Results With injection of 100μL HRH (10 mg/mL), the LC50 (LC: lethal concentration) and LC100 from tiv were 4.30±0.41mg/mL and 11.83±3.13 mg/mL; yet the icv’s expressions under injection of 40μL HRH (10 mg/mL) were 3.83±0.69 mg/mL and 9.68±3.10mg/mL, respectively. The elapsed time of cessation into breathing/heart-beating by tiv infusion of HRH was 0.95±0.25 min/7.04±0.40 min, whereas 0.58±0.17 min/6.68±0.61 min by icv. Under microscope, the pathological changes of congestion and edema were found in brain tissue; and from transmissible electronic microscope were revealed the cerebral ultrastructure pathomorphological changes: the widened intervals between nerve cells, the abnormal mitochondria/rough endoplasmic reticula/lysosomes.Conclusions The animal model of mouse’s LLD from heroin has been set up with the resulted histopathological changes of nervous system.

Key words: heron; lightning-like death (LLD); pathology; ultrastructure

目前全球有近2亿人有毒品滥用史, 我国记录在册的吸毒人员已达百万之众, 根据《2017中国毒品形势报告》, 阿片类、海洛因吸毒人员超过90万人。海洛因成瘾是一种与多因素有关的慢性、复发性脑病, 同时也成为严重危害人类健康并为全球所关注的公共卫生问题。近年来由于海洛因吸食过量而导致的死亡和毒品注射杀人案件也屡见报端[1, 2, 3]。公安法医实践中发现, 快速大量注射海洛因闪电死亡因为机体代谢时间极短, 有时仅通过毒化检测难以明确中毒剂量, 为了解决这一检验鉴定难题, 本实验利用海洛因通过注射尾静脉及侧脑室建立闪电式死亡模型, 确定闪电死亡的注射浓度及超微结构变化, 试图为海洛因滥用所致的机体死亡和与海洛因有关的毒品注射杀人等刑事案件提供实验依据和观察指标。

1 材料与方法
1.1 实验耗材

C57BL/6J小鼠, 雌雄不限, 体重（20± 2） g, 购于辽宁省中医学院动物实验室。 盐酸海洛因, 购于国家麻醉品实验室, 生理盐水配制为10 mg/mL溶液, 4 ℃避光保存。

1.2 实验仪器

普通光学显微镜（CX-21型, 日本奥林巴司光学工业株式会社）, 透射电镜（JEM-100 CXⅡ 型, 奥林巴司光学工业株式会社）, 超薄切片机（LKBⅤ 型, 瑞典LKB公司）, 石蜡切片机（德国莱兹公司）。

1.3 动物分组

30只小鼠随机分为10组, 每组3只, 分别为：icv HRH（10 mg/mL, 40 μ L）呼吸停止即刻和0.5 h取材组、tiv HRH（10 mg/mL, 100 μ L）呼吸停止即刻和0.5 h取材组、icv 生理盐水（NS, 40 μ L）同步断髓致死后即刻和0.5 h取材组、tiv NS（100 μ L）同步断髓致死即刻和0.5 h取材组、直接断髓处死即刻和0.5 h取材组。

1.4 行为观察[4]

给药后小鼠出现躁动、呼吸困难、昏迷、抽搐、震颤、大小便失禁等中毒症状, 死亡时间范围为1~8 min。

1.5 电镜实验

取脑干、第三脑室区域, 切成1 mm3小块, 于2.5％戊二醛溶液前固定过夜, 1％四氧化锇后固定2 h, 乙醇梯度脱水, 环氧树脂包埋, 超薄切片机切片, 醋酸铀和柠檬酸铅双重染色, 电压80 kV, 电流10 μ A, 放大6 000倍进行形态学观察。

2 结果
2.1 注射HRH后症状出现及死亡时间

结果见表1。

表1 注射HRH后出现呼吸停止至死亡的时间 (n=10, $\bar{x}$± s) Table 1 The time from respiratory arrest to death after HRH injection
2.2 HRH致死浓度（Lethal concentration, LC）

2.2.1 侧脑室注射HRH组

按照简化机率法计算出icv HRH LC50的95%可信区间为（3.83± 0.69） mg/mL; LC90 的95%可信区间为（7.26± 1.34） mg/mL, LC100的95%可信区间为（9.68± 3.10） mg/mL（表2）。

表2 侧脑室注射HRH组死亡率和致死浓度的检测 Table 2 Mortality and lethal concentrations by lateral ventricular injection of HRH

2.2.2 尾静脉注射HRH组

按照简化机率法计算出tiv HRH的LC50的95%可信区间为（4.30± 0.41） mg/mL; LC90的95%可信区间为（7.38± 0.49） mg/mL; LC100的95%平均可信区间为（11.83± 3.13） mg/mL（表3）。

表3 尾静脉注射HRH组死亡率和致死浓度的检测 Table 3 Mortality and lethal concentration by tail vein injection
2.3 形态学改变

光镜下, HRH组, 可以看见脑组织结构疏松, 脑实质内小静脉、毛细血管扩张、淤血, 血管和细胞周围间隙增宽, 可见围血管性出血; 部分锥体细胞胞体肿胀, 周围间隙增宽, 星形胶质细胞部分体积增大, 淡染（图1）。

图1 海洛因急性中毒闪电死亡脑实质HE染色（放大倍数40× , a：血管扩张、淤血, 围血管性出血（▲）; b：脑组织结构疏松, 细胞周围间隙增宽（& #10142; ））Fig.1 HE staining of the brain parenchyma after lightning-like death from acute heroin poisoning (amplified to 40× , a. vasodilation, congestion and perivascular hemorrhage; b. loose brain tissue structure, widened pericellular space)

电镜下, ControL组、tiv NS组和icv NS组, 电镜观察未见明显超微结构变化（图2a）; 注射HRH 0 h组电镜下可见粗面内质网扩张、核糖体脱落（图2b）, 胞质内线粒体数量减少、肿胀、嵴断裂、消失、空泡变（图2c）; 有髓神经纤维数量减少, 间隙增宽; 胞质内高尔基复合体扩张（图2d）; 注射HRH 0.5 h组轴突内轴浆成分减少, 髓鞘层次不清晰, 排列紊乱, 局部有裂隙, 扭曲、断裂, 消失（图2e）; 细胞核呈不规则改变, 萎缩, 细胞核核膜增宽, 异染色质较多, 聚集成块, 凝集在核的周边（图2f）。

图2 HRH中毒闪电死脑组织超微结构变化（放大倍数6000× 。a：对照组胞质内可见粗面内质网〔ER〕, 线粒体〔mit〕, 核糖体〔RI〕, 溶酶体〔LYS〕; b：HRH 0h见异染色质〔heterochromatin, HC〕呈团块凝聚, 部分细胞器结构呈空泡变〔* 〕; c：HRH 0h见粗面内质网〔ER〕扩张, 脱颗粒, 线粒体〔mit〕肿胀; d：HRH 0h胞质内高尔基〔Golgi〕复合体扩张; e：HRH 0.5h见有髓神经纤维分离〔▲〕, 轴突出现空泡变〔* 〕; f：HRH 0.5h见神经细胞核型不规整, 细胞器空泡变明显〔* 〕）Fig.2 Ultrastructural changes of dead brain tissues from HRH poisoning (amplified to 6000× . a. the controlled rough endoplasmic reticulum (ER), mitochondria (mit), ribosome (RI), lysosome (LYS) in the cytoplasm; at 0h: b. the agglomerated heterochromatin (HC) and some vacuolated organelles (* ), c. ER’ s dilatation and degranulation, mitochondrial swelling, and d. cytoplasmic golgi complex dilatation; at 0.5h: e. myelinated nerve fibers separating (▲), the vacuolated axonal prominence (* ), and f. the irregular neural nuclei, the vacuolated organelle (* ))

3 讨论

自上世纪90年代以来, 由于静脉注射海洛因的剂量过大, 推注速度过快引起的意外死亡或他杀致死的案件呈逐年增加的趋势[5]。然而大量国内外研究聚焦海洛因成瘾机制以及慢性成瘾对体内脏器的形态和功能指标的影响方面, 对海洛因过量快速死亡的致死浓度及脑组织超微结构病理改变这些方面研究甚少。

本实验通过小鼠侧脑室及尾静脉注射两种给药途径, 研究了海洛因注射导致小鼠闪电式死亡的中毒症状, 成功复制了海洛因中毒导致小鼠闪电式死亡的动物模型; 并通过不同注射途径, 在固定其给药容积的条件下, 确定了不同致死量条件下的致死浓度：以icv 40 µ L方式注射HRH的LC100为（9.68± 3.10）mg/mL, 而以tiv 100 µ L方式注射HRH的LC100为（11.83± 3.13） mg/mL。海洛因中毒主要抑制呼吸中枢功能, 由于神经细胞对缺氧最敏感, 所以在HRH中毒时, 脑组织的病理形态学改变出现最早, 因此, 神经系统形态学改变可能是HRH注射闪电死亡的辅助诊断指标之一。本实验中, HRH经过不同途径的注射后, 脑组织可见血管扩张淤血、细胞和血管周围间隙增宽、个别神经细胞变性等脑水肿改变, 考虑到上述形态改变是中毒死亡后脑组织一般病理改变情况, 具有一定的局限性和非特异性, 因此本研究进一步利用透射电镜观察神经系统形态学改变。电镜下, HRH 0 h组可见胞质内线粒体数量减少、肿胀、嵴断裂、空泡变; 粗面内质网扩张、核糖体脱落; 髓鞘层次不清晰, 排列紊乱, 局部有裂隙, 扭曲、断裂; 细胞核呈不规则改变, 萎缩, 细胞核核膜增宽, 出现聚集成块的异染色质, 而HRH 0.5 h时脑组织的超微结构改变在程度上要明显重于呼吸停止即刻组, 尤其是线粒体完全空泡变, 有髓神经髓鞘空泡样改变等特征更突出, 这些改变一方面提示大剂量注射HRH即刻就会出现神经损害, 另一方面, 随着时间的延长, 超微结构的改变程度将更加明显, 有助于法医在HRH血液浓度因腐败或死后再分布导致诊断效能下降的情况下, 通过形态学改变辅助诊断急性HRH中毒死亡。

综上, 海洛因中毒致小鼠闪电式死亡动物模型的建立, 为进一步研究海洛因中毒致死提供了有效的方法, 利用动物模型推断人体致死浓度可为公安机关鉴定此类案件提供参考依据。

参考文献
[1] 李峰, 唐骏. 肌肉注射毒品他杀1例[J]. 法医学杂志, 2010, 26(1): 14. [本文引用:1]
[2] 闫春霞, 唐承汉, 黄景峰, 等. 毒品相关死亡及目前法医鉴定中存在的问题[J]. 中国法医学杂志, 1999, 14(3): 186-187. [本文引用:1]
[3] 卢延旭. 法医毒理学实验[M]. 沈阳: 中国刑事警察学院出版社, 2002: 85-88. [本文引用:1]
[4] 牛勇, 卢延旭, 董鹏. 小鼠注射海洛因即刻死后体内ACP和SDH活性变化[J]. 中国法医学杂志, 2007, 22(3): 190-191. [本文引用:1]