泥土微生物数量众多, 每克泥土中就含有几亿到几百亿个, 其种类和数量随成土环境及土层深度的不同而变化。故泥土微生物物证的突出特点就是包含信息量巨大。不同微生物群落的组成特点以及一些特定微生物的存在无不反映着相应土壤样本的属性, 诸如地理特征、土壤类型、土地利用方式等, 这些信息对于缩小案件侦查范围, 查明案件的发生区域甚至具体位置等都具有一定的帮助。

微生物是活的生命体, 其在土壤中的存在和分布受天气、地上植被、pH值、水分、温度等因素的影响, 实质上形成一个动态平衡的微生物群落^[1]。所以不同土壤样品间的微生物群落呈现出非常高的多样性。这一特点使得土壤微生物检验有更高的区分精度。最新的研究表明土壤微生物检验可以将两块相隔25 m的地块区分开^[2]。因此若案发现场与发现泥土的地方相隔很近从而土壤的理化性质差异不明显时, 微生物检验或能提供有价值的线索。

微生物是反映尸体腐败的敏感指标^[3], 因此尸体上微生物群落结构或组成的变化可成为死亡时间推断的新依据。有研究通过一个小鼠模型系统发现, 在尸体腐烂过程中, 微生物群落的变化是动态、可测量且重复的, 能够用于估计死后3~48 d内的死亡时间。相关科学家把微生物在尸体腐败过程中扮演的角色形象地称之为“ 微生物钟” ^[4]。

0.2~1g湿土就可以进行一次微生物分析, 即使案发现场仅存的一点可疑泥土也有可能进行微生物检验。泥土微生物检验的优势可见一斑。

16S rRNA基因是细菌编码rRNA相对应的DNA序列, 存在于所有细菌的基因组中, 其同时具有种属高度保守性和不同菌株之间的变异性。因此, 通过构建16S rRNA克隆文库, 进而分离出不同的序列, 再通过序列比对鉴定细菌种类, 就可以研究泥土微生物的多样性和菌种区分。但此方法工作量大, 是否能涵盖细菌群落特征依赖于所构建文库的质量。高通量测序技术出现后, 通过扩增和测定细菌16S rRNA高变区的序列信息, 为分析土壤微生物群落多样性找到了一个基本的方法^[7]。2002年, Horswell等^[8]首先将细菌16S rDNA分析方法应用于法庭科学的土壤分析中。

变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE）是利用DNA在不同浓度变性剂中解链行为不同所致电泳迁移率的差异, 将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开的技术。该技术突出优点是可从凝胶中切下谱带, 然后通过测序来揭示群落成员间系统发育的从属或先后关系。虽然由于技术方法的局限, 2005年Lerner等^[9]在一个模拟实验中用DGGE方法未能将嫌疑人家中和现场的泥土区分开, 但DGGE方法仍可作为一种分析细菌群落的预实验, 当实验样本较多时, 就可考虑在大规模高通量测序前先采用该法对样本进行预筛, 以获得测序样本。

RFLP是对特定的PCR扩增产物用限制性内切酶进行切割并电泳, 根据酶切后DNA片段长度不同及标记片段种类和数量的异同而对不同来源的DNA进行差异性分析的技术, 该技术也广泛应用于微生物群落结构以及多样性的评测。T-RFLP方法是基于RFLP技术的创新^[10]。应用该方法, 在以细菌通用引物扩增基因时, 将其中一条引物的5’ 末端用荧光素进行标记, 而后经特定限制性内切酶消化扩增基因所产生的长度不同的片段, 用DNA自动测序仪分离, 就可测得带荧光标记端的DNA片段图谱。由于每种菌荧光标记5’ 末端的DNA片段长度是唯一的, 经过比对, 就可直接鉴定出图谱中的单个菌种。由于T-RFLP技术能对接于法医DNA实验室的技术平台, 所以其最有潜力成为适于法庭科学泥土物证检验的一种技术方法。Quaak等^[11]通过基于Bray-Curtis距离的方法建立土壤样本的T-RFLP图谱比较模型, 对未知样本预测其可能的来源, 经与荷兰警察局合作验证该模型, 证明该方法非常可信。2017年Habtom等^[2]比较了目前一些主流的法庭科学土壤微生物的检验方法, 也发现T-RFLP方法不仅结果可信, 而且对距离很近的相似土壤也有很高的区分能力。2008年葛芸英等^[12]在国内法庭科学领域首次利用T-RFLP方法对5个不同来源和4个同样来源的土壤样本进行了比较分析, 获得了国内最早的泥土微生物物证研究成果。

16S-23S rRNA基因间隔区(intergenic spacer region, ISR)因其具有相当好的保守性和可变性而备受关注, 可应用于种以下水平的分类鉴定。RISA技术能揭示片段长度的不同。长度不同的扩增产物可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离然后银染显色成像。此技术可以准确评估群体指纹结构, 每一条带至少代表一个物种。16S-23S之间区域的PCR扩增所用的是荧光标记快速引物, 此引物可实现自动毛细管电泳泳动进度的直观检测。Demaneche等^[13]通过设计一个模拟案件, 把“ 中心现场” “ 嫌疑人家” “ 距中心现场25 m远” 等几个地点的土样在Miseq平台上进行16S rRNA和RISA分析, 以此评估土壤细菌群落的区分效力, 结果发现16S rRNA和RISA两种方法都可区分相隔25 m远的两个地点的泥土。但若是推测土壤来源, 则需要两种方法结合。

第二代测序平台以Illumina公司的Solexa、Roche公司的454和Life Technologies 公司的SOLiD、Ion Torrent为代表。这些测序平台最大的特点是数据产出通量高, 能在土壤微生物物种、结构、功能和遗传多样性的研究中获得丰富的信息。由于其检测速度快, 数据量大, 此项技术现在也被法庭土壤微生物学研究者广泛使用。2012年以来随着高通量测序方法引入到土壤微生物研究中, 利用细菌16S rRNA、真核18S rRNA、植物trnL（即转运RNA的L基因）内含子、真菌内转录间隔区ITS1（internal transcribed spacer）rDNA等遗传标记对土壤中微生物群落进行基因水平的检测逐渐开展起来。目前已有利用16S rRNA、18S rRNA、ITS等多种分子标记对土壤进行比对区分的研究, 证明了NGS在多种标记的法庭科学土壤分析中所具有的潜在用途和价值^[7]。苑美青等^[14]利用高通量测序技术在国内首次对一起埋尸案中的泥土微生物物证进行了研究和应用, 结果表明埋尸工具上粘附的泥土与埋尸现场的泥土具有最高相似度, 从而为泥土微生物物证应用提供了一种新思路。

在有比对样本的情况下, 通过土样中泥土微生物群落特征比对确定两份或多份泥土是否来源于同一个地域, 或者通过嫌疑工具、衣物上的泥土与现场土样比对, 从而确定嫌疑工具、衣物与现场的关联性。如果有多个嫌疑工具, 则可通过多个工具上的泥土与现场土样进行比对, 确定哪个工具上的泥土与现场土样最相似。

若没有比对样本时, 可通过泥土物证中微生物群落的分布特点推断泥土物证来源地的土壤类型, 或者推断泥土物证来源地土壤的利用方式, 比如是稻田土、菜地土、河边土, 甚至可推测泥土样本的大致地理位置以及根据物证上粘附的泥土微生物推断嫌疑人的滞留时间, 等等。目前泥土微生物物证检验还不能做到同一认定, 但却可以不同程度地揭示现场检材物证与比对样本之间的关联性^[15]。假以时日, 就能够给出明确的以相似性指数等表示的适合法庭证据采信的鉴定结论。随着研究的持续和深入, 相信泥土微生物物证在法庭科学领域会发挥更大的作用。

在二代测序技术与方法日趋成熟的背景下, 探寻适合于案件现场的泥土微生物检验、数据分析方法, 更快、更准确地了解泥土物证中微生物群落的分布状况并进行分析比对确有成功的研究与应用实践, 但是目前国内外的研究大多还停留在个案研究和小范围应用阶段, 尚没有统一或者标准的检验和生物信息数据分析方法。因此, 大量的研究工作仍有待开展。

由于泥土微生物是活的有机体, 其数量和分布受季节、温（湿）度等情况的影响较大, 而泥土样品采集后又需低温保存, 宜尽快进行实验室检验以最大程度呈现或还原采样地的微生物分布情况。因此, 需制定泥土微生物物证采集的针对性原则、规定以及可操作的方法、规则, 以加大基层侦查办案及现勘技术人员对泥土物证采集的重视, 进而提高土壤物证的信息挖掘量和证据利用效率。

泥土微生物检验具有对泥土物证来源地推断的潜能, 因此, 建立法庭科学泥土微生物数据库是必然的发展趋势。应参考并借助全国范围内典型区域的土壤微生物数据库, 建立符合法庭科学特点的泥土微生物物证专业数据库, 这是未来泥土微生物物证应用于实际案件鉴定的基础保证条件。

泥土微生物检验作为一个新兴的物证检验方向, 有其独特的优势, 但是由于泥土微生物物证存在的广泛性、复杂性、异质性和可转移性, 即便是对单一未知样本的来源地或地域进行推断, 仅凭泥土微生物物证一个方法并不能解决所有问题, 需要建立由理化、植物、矿物、夹杂物等多种检验方法所组成的综合检测评判体系, 从泥土物证的各个角度进行分析, 对结果做出综合研判, 最终使现场最常见的泥土物证更好地发挥其在法庭科学中的应用价值。