mRNA携带有所表达蛋白质的氨基酸序列基因信息。一个成年人含有大约210种不同功能的细胞类型, 而每种类型的细胞都有其各自特性, 如大小、形状、代谢类型以及对信号的应答反应等。高度分化的细胞因其功能的特异性而会表达特定的mRNAs。不同体液含有多种类型的细胞, 每一种细胞又有各自独特的基因表达谱, 即所谓转录组^[2], 对体液转录组做研究、寻找新的特异性标记分子, 正是法医学工作者关注的热点。不同体液中特定的多细胞组合转录形成的特异性表达谱将能为体液斑迹组织来源鉴定提供理论参考和物质依据。

长期以来, mRNA因其自身的不稳定性、易降解而被法医学研究与应用所忽略。但研究发现RNA在干燥载体上具有较好的稳定性^[3], Zubakov等^[4]研究表明在保存180 d的血液和唾液斑痕中能够检测到组织特异的mRNA分子标记。2003年Bauer等^{[5, 6]}证明利用RT-PCR方法可在保存15年的干燥血迹中检测到高水平的β -actin和cyclophilin A, 并由此提出假设— — 利用转录本恒定的降解速率推断血液斑痕的形成时间。

Setzer等^[7]针对血液、唾液、精液和阴道分泌物4种体液的斑迹在不同储存条件下对转录本的影响做了全面的研究, 结果表明室温下存储547 d的样品中能够成功地检测到mRNA, 并且其质量可以达到mRNA分析的标准。在室外且不受潮湿如雨水等污染的条件下, 保存7 d的唾液斑/精斑、30 d的血斑和180 d的阴道分泌物斑痕中仍然能够检测到组织特异的mRNAs, 而在雨水影响下体液斑迹中转录本的稳定性将受到很大破坏。

外周血、月经血、唾液、精液和阴道分泌液等是法医物证常见的体液类型。大量的研究表明, 不同组织来源的体液均具有特异的mRNAs。其中, 外周血的标记分子与血红蛋白、红细胞膜蛋白和白细胞蛋白有关。月经血是由血液、退化的子宫内膜和阴道上皮细胞等多种组织组成的混合样本, 血液中的标记分子HBB、CD93和JAML在其中都有相对的低表达, 但其中稳定存在的标记分子主要为基质金属蛋白家族成员MMPs。精液则主要分为两部分, 一是精子细胞, 标记分子有PRM1和PRM2; 二是精浆, 标记分子有TGM4、SEMG1、PSA和MSMB, 精浆中的标记分子可用于先天性无精子症或是结扎男性精液的检验（详见表1）。理论上, 在所有细胞中稳定表达的管家基因均可作为法医学体液斑迹来源鉴定的阳性对照, 但主要受不同细胞代谢类型差异的限制, 目前法医学上仍在寻找合适的阳性对照, 现有研究结果如表2所示。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 法医学上常见体液斑迹中具有组织特异性的mRNA标记分子 Table 1 mRNA markers eligible for forensic body fluid identification 体液类型 基因 染色体位置 功能/蛋白在细胞内定位 参考文献 外周血 Hemoglobin α (HBA) 16p13.3 血红蛋白A的α 亚基 [8], [99], [10] Hemoglobin β (HBB) 11p15.5 血红蛋白A的β 亚基 [11], [9], [12], [13], [14], [10] Aminolevulinate synthase 2 (ALAS2) Xp11.21 血红素生物合成途径中催化第一步反应的红细胞特异性线粒体酶 [15], [9], [16], [10] CD3γ molecule (CD3G) 11q23.3 T细胞受体CD3复合物的一部分, 在将抗原耦合到细胞内信号转导通路上发挥重要作用 [9], [10] Ankyrin 1 (ANK1) 8p11.21 红细胞膜蛋白, 主要连接细胞膜骨架和细胞质膜 [9], [10] Porphobilinogen deaminase (PBGD) 11q23.3 血红素生物合成途径的第三种酶 [17], [11], [9], [14], [10] 外周血 β -spectrin (SPTB) 14q23.3 红细胞膜蛋白 [17], [15], [11], [9], [14], [10], [18] Glycophorin A (Glyco A) 4q31.21 一种重要的人红细胞膜的唾液酸糖蛋白, 携带M或N组抗原 [19] CD93 (C1qRP) 20p11.21 一种在内皮细胞、单核细胞、中性粒细胞上表达的跨膜蛋白 [12], [13] Junction adhesion molecule like (JAML) 11q23.3 连接黏附分子家族成员, 属于分泌性Ⅰ 型跨膜糖蛋白, 在免疫调控、炎症反应和损伤修复中起重要作用 [12], [13] 月经血 Matrix Metalloproteinase 7 (MMP7) 11q21-q22 三个标记分子均为细胞外基质分解过程中的内肽酶成分 [3], [20], [15], [21], [11], [16], [12], [13], [18] Matrix Metalloproteinase 10 (MMP10) 11q22.2 [3], [20], [15] Matrix Metalloproteinase 11 (MMP11) 22q11.23 [11], [19], [12], [13] 唾液 Histatin 3 (HTN3) 4q13 口腔内非免疫宿主防御系统的一部分 [17], [15], [11], [22], [19], [16], [12], [13], [23] Statherin (STATH) 4q11-q13 结合羟基磷灰石的唾液蛋白, 在口腔中作为沉淀磷酸钙盐的抑制剂 [17], [15], [11], [22], [19], [16], [12], [13], [23] Mucin 7 (MUC7) 4q13.3 小唾液粘蛋白, 能够促进清除口腔细菌, 并能协助咀嚼、讲话和吞咽 [23] Proline rich proteins 1 (PRB1) 12p13.2 三个标记分子均为人唾液糖蛋白 [24] Proline rich proteins 2 (PRB2) 12p13.2 [24] Proline rich proteins 3 (PRB3) 12p13.2 [24] 精液 Protamine 1 (PRM1) 16p13.2 在精子发生过程中, 精蛋白取代组蛋白对精核中高度凝集的染色质具有重要作用 [25], [17], [15], [11], [12], [13], [23] Protamine 2 (PRM2) 16p13.13 [25], [17], [15], [11], [22], [19], [16], [23] Transglutaminase 4 (TGM4) 3p21.31 转谷酰胺酶家族催化肽结合的谷氨酰胺残留与肽结合的赖氨酸或用一级胺的不可逆交联, TGM4特异性在前列腺发挥作用 [19], [16], [23] Semenogelin 1 (SEMG1) 20q12-q13.2 起源于精囊的蛋白质 [22], [12], [13], [23] Prostate-specific antigen, Kallikrein 3 (PSA) 19q13.33 丝氨酸蛋白酶, 存在于精液、前列腺液、男性血清、男性和女性尿液中 [8] 阴道分 泌物 Mucin 4 (MUC4) 3q29 黏蛋白阻止病原体穿透生殖道上皮的表面, 调节精子进入子宫 [17], [8], [11], [16], [12], [13] Human beta-defensin-1 (hBD-1) 8p23.1 泌尿生殖组织的抗菌肽 [17], [11], [12], [13], [18]

表1 法医学上常见体液斑迹中具有组织特异性的mRNA标记分子 Table 1 mRNA markers eligible for forensic body fluid identification

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 法医学上用于体液斑迹组织来源鉴定的管家基因 Table 2 Housekeeping genes for forensic body fluid identification 基因名称 染色体位置 参考文献 Rig encodes ribosomal protein (S15) 19p13.3 [24] β -actin (ACTB) 7p22 [24], [12], [13] Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (GAPDH) 12p13 [24], [21], [11], [19], [12] 18S-rRNA 22p12 [11], [12], [13], [18] Transcription elongation factor (TEF) 22q13.2 [19] β 2-microglobulin (B2M) 15q21.1 [23] Ubiquitin C (UBC) 12q24.31 [23] Ubiquitin conjugating enzyme (UCE) 16p13.3 [19], [23]

表2 法医学上用于体液斑迹组织来源鉴定的管家基因 Table 2 Housekeeping genes for forensic body fluid identification

Northern印迹法和斑点杂交法是分子生物学中检测mRNA的传统方法。Northern印迹法可测单RNA或poly(A)+RNA样品中特定的mRNA分子大小, 也可作定量分析。在早期研究中, Northern印迹法是验证克隆和生物信息学分析所得mRNA数据可靠性的方法; 斑点杂交法是利用核酸单链分子碱基互补的原理, 用标记的已知RNA核苷酸片段作为探针, 与待测样品相应的目的片段结合形成稳定的杂交体, 经显色反应, 在光学显微镜或电子显微镜下观察相应的mRNA分子。但这两种传统的检测方法自动化程度和灵敏度都较低, 而对样本的需求量较高, 要微克级样品才能避免假阴性, 且不能进行高通量的检测^[28]。

终点逆转录PCR (endpoint reverse transcription-polymerase chain reaction, Endpoint RT-PCR) 是将分离自样品中的RNA经逆转录酶将mRNA逆转录为cDNA, 通过PCR扩增出目标片段, 再以琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳检测目的片段的方法^[26]。在RT-RCR过程中常用的引物有Oligo(dT)和Random Hexamer, 其中Oligo(dT)特异性高, 适合用于带有poly(A)尾的mRNA反转录, 但对于较长的mRNA, 通常不能延伸到5’ 端。Random Hexamer是一个混合物, 有6个碱基长度, 它的3’ 和5’ 端都有-OH, 因此可以向两端延伸。该引物特异性低, 常用于获取5’ 末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。由于样品RNA随暴露时间的增长会降解为小片段, 因此在操作中以50~300 bp的扩增片段长度为宜。人类基因是断裂基因, DNA转录为mRNA时要经历mRNA剪切, 因此一般采用mRNA的外显子-外显子接头作为引物的结合部位, 以减少基因组DNA干扰^[3]。目前国际法医遗传领域, 对PCR扩增产物检测主流技术是毛细管电泳检测技术 (capillary electrophoresis, CE), 又称“ 高效毛细管电泳” 。该方法具有样品用量微、利于重复检测, 分离高效、快速且与检测同时完成等优点, 不足是只能对样品进行定性检测。

Bauer等^[3]利用RT-PCR结合琼脂糖凝胶电泳方法第一个探索mRNA用于体液鉴定的方法, 结果表明MMP和鱼精蛋白mRNA可以分别用来鉴定月经血和精子^{[20, 25]}。Juusola等^[24]证明在生物斑痕中的RNA具有重建性, 从斑痕中提取的RNA的数量和质量均能满足ACTB、GAPDH、S15三个内参基因分析的需要, 并且提出STATH、HTN3、PRB1、PRB2和PRB3可以用于唾液鉴定。

将mRNA分析用于犯罪现场体液斑迹判定的最大挑战是RNA降解导致结果出现假阳性。许多mRNAs不是绝对的体液特异, 即有的mRNAs可能在某种体液中表达水平很高, 但同时也会在其它体液中低表达, 降解后的RNA产生的弥散条带很容易造成结果误判。实时荧光定量PCR技术 (Realtime PCR, qRT-PCR) 具有高灵敏度和高通量的优势^[27]。该方法在反应体系中加入荧光基团, 通过荧光信号累积实时检测整个PCR进程, 在扩增的指数期连续检测荧光信号强弱变化而即时测定特异性产物的量, 从而实现对起始模板进行定量分析。应用qRT-PCR法, 可以较准确地定量检测低丰度表达的目标mRNA分子。

Nussbaumer等^[8]采用实时定量PCR (qRT-PCR) 方法检测不同体液中kalikrein 3（KLK）的含量, 结果显示KLK转录本仅存在于精液中, 而在血液、唾液和阴道分泌液中检测不到。在这种转录本表达绝对特异的条件下, 终点逆转录PCR方法是适用的。同时研究发现hemoglobin-alpha-1 (HBA) 和mucein (MUC) 虽分别在精液和阴道分泌液中高表达, 但在其它体液中同样能够检测到, 因此其需要利用定量方法来检测。在定量PCR分析中, 合适的标准化策略对减小实验误差有重要作用^{[29, 30, 31]}。在定量分析情况下, 可以通过可靠的内参来消除假阴性结果, 一个合适的内参其表达量应该比目的基因要低。

基因芯片（gene chip）, 又称DNA微阵列（DNA microarray）, 该方法是将DNA分子固定于支持物上, 并与标记的样品杂交, 通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的数量, 进而得知样品中mRNA的表达量。基因芯片技术是一种高通量研究mRNA表达的方法, 可以短时间内同时检测大量mRNA的表达丰度, 是目前检测整个基因组内组织特异性mRNA表达丰度比较有效的手段。这种方法信息量大但质量低, 常伴有假阳性结果, 且基于不同技术原理的芯片检测效果存在差异, 一般用于前期筛选^[32]。

随着全基因组DNA测序技术的成熟, 功能基因组学研究成为主流, 其中包括转录组学、蛋白组学、代谢组学等。高通量测序技术是一种快捷可靠的获取转录组信息的方法。目前, 转录组测序 (RNA sequencing, RNA-Seq) 技术在研究转录组组装、基因表达定量与基因差异表达、转录本变异检测（如基因融合、编码区SNP研究）以及基因共表达和调控网络等方面发挥重要作用, 相对于传统的芯片杂交平台, 转录组测序技术具有高灵敏度、可数字化信号、系统性、个体组织差异性、时间独立性等优势, 能够提供最全面的转录组信息。

2012年, 美国研发出Total ScriptTM RNA-Seq试剂盒, 5 ng的总RNA样品（含有rRNA）即可完成全转录组测序, 且不需要片段化RNA, 甚至能够完成单细胞水平的转录组分析^[33]。国内华大基因同年推出微量转录组测序技术（TruSeq）, 实现了高效、稳定的微量转录组测序, 便利于法医学领域体液斑迹组织来源推断中发现新的标记分子。Hanson等^[34]利用RNA-seq技术结合文献检索的方式筛选出100多个皮肤的候选mRNA标记分子。经验证, 其中有5个标记分子（LCE1C、LCE1D、LCE2D、CCL27、IL1F7）具有高度的皮肤特异性, 从皮肤拭子或各种接触性样品中提取到5~25 pg总RNA即可满足皮肤鉴定。2013年, Hanson等^[35]再次利用RNA-seq技术筛选了200多个阴道分泌物候选mRNA标记分子, 经验证有6个标记分子（SFTA2、FUT6、DKK4、IL9、MYOZ1、CYP2B7P1）未曾被报道且具有高度的特异性, 其中MYOZ1和CYP2B7P1能够显著地将阴道分泌物与其它体液包括上皮细胞, 特别是唾液和皮肤进行区分, 并且CYP2B7P1与目前已知的体液/组织无交叉反应。

2018年, EUROFORGEN/EDNAP^[36]联合组织了一次大规模平行测序试验, 验证靶向mRNA测序用于体液斑迹鉴定结果的有效性。该试验以外周血、唾液、精液、阴道分泌物、月经血和皮肤的干燥斑迹为对象, 通过Illumina MiSeq/FGx和the Ion Torrent PGM/S5两个测序平台分别设计了针对上述6种体液斑迹的靶向mRNA序列引物池, 结果证明基于大规模测序技术的靶向mRNA测序可以应用于体液斑迹组织来源推断。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同mRNA分析技术的特点比较 Table 3 Comparison among the different mRNA analytic techniques 技术名称 定量/定性分析 样本需求量 灵敏度 假阳 性率 通量 易操作程度 Northern印记法 定性, 可做定量 大 低 高 低 易 斑点杂交 定性 大 低 高 低 易 终点逆转录PCR 定性 小 高 低 低 易 实时荧光定量PCR 定量 小 高 低 低 易 基因芯片 定性 大 低 高 高 难 二代测序 半定量 大 高 高 高 难

表3 不同mRNA分析技术的特点比较 Table 3 Comparison among the different mRNA analytic techniques

目前报道的用于建立复合体系的技术方法包括RT-PCR和qRT-PCR。2005年Juusola等^[17]提出体液
鉴定的多重PCR方法, 证明基于毛细管电泳的RT-PCR方法能够鉴定血液、唾液、精液和阴道分泌物。利用8个体液特异的mRNAs（血液标记分子SPTB、PBGD, 唾液标记分子STATH、HTN3, 精液标记分子PRM1、PRM2, 阴道分泌物标记分子hBD-1、MUC4）, 能够检测四种单一体液或混合体液斑迹。同时结果表明利用0.2~12 ng的RNA能够成功地鉴定体液斑迹, 由此说明, 多重PCR实验的灵敏度已经能够满足法医学的需求。2007年Juusola和Ballantyne^[15]建立荧光定量PCR复合检测体系, 用于鉴定血液、唾液、精液和月经血, 该体系中血液特异性标记PBG被ALAS2替代, 月经血的标记分子选用MMP7、MMP10, 筛选GAPDH作为管家基因用来标准化体液特异性基因的表达。与基于毛细管电泳平台的复合检测方法相比, 荧光定量PCR复合检测体系的优势在于定量检测基因表达, 其检测的灵敏度可以提高5至40倍甚至更高, 且能够检测0.000 02~500 ng范围的RNA。2012年Lindenbergh等^[12]建立起19个mRNA标记分子组成的Endpoint PCR复合体系（3个管家基因ACTB、GAPDH、18S-rRNA, 3个血液标记分子HBB、CD93、AMICA1, 2个唾液标记分子STATH、HTN3, 2个精液标记分子PRM1、SEMG1, 2个月经分泌物标记分子MMP7、MMP11, 2个阴道黏膜标记分子MUC4、HBD1, 3个黏膜标记分子KRT4、KRT13、SPRR2A和2个皮肤标记分子LOR、CDSN）检测6种体液斑迹, 该体系实现首次将皮肤特异的mRNA分子标记加入到复合检测体系中, 结果显示该mRNA复合检测体系对血液、精液和唾液都有很高的灵敏性, 而检测体系中的皮肤标记分子能够检测来自手、足、背部和唇部的皮肤, 舌部的皮肤检测结果呈阴性, 同时该实验证明每一种体液斑迹应至少使用两个mRNA进行确认。Xu等^[37]使用的复合扩增系统XCYR1可以同时检测12个mRNA位点和2个管家基因, 可以完成常见体液斑迹以及汗液和尿液的检测。目前已有的检验方法已经能够一次性检验20个以上的mRNA标记, 可对数种常见的法医体液斑迹和混合斑进行检验。

为评估mRNA分析在体液鉴定中的有效性和可重复性, 2011年以来, 欧洲DNA分型工作组（EDNAP）先后组织了6次从体液斑迹中提取DNA和RNA并进行分析的联合试验^{[10, 14, 23, 38, 39]}, 利用基于毛细管电泳的mRNA检测技术对mRNA在体液组织来源推断中的实用性与可行性进行检测, 研究结果见表4。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 EDNAP对mRNA分析体系的评估试验 Table 4 Evaluation test on mRNA analytic system by EDNAP 试验序号 体液类型 mRNA标记分子 研究结果 第一次 血液 HBB、SPTB、PBGD 在16个基本没有RNA操作经验的实验室中, 除一个外, 其它实验室均能成功地提取和分析统一提供的血液斑痕样本中组织特异的mRNA 第二次 血液 高敏感性复合检测体系：HBA、HBB 中敏感性复合检测体系：ALAS2、CD3G、ANK1、 PBGD、SPTB 该复合体系可以检测新鲜的或者模拟现场的样品, 甚至是陈旧的血液斑痕 第三次 唾液、精液 唾液：HTN3、STATH、MUC7 精液：PSA、PRM2、SEMG1、TGM4和PRM1 基于mRNA分析的体液鉴定体系能够与当前DNA分型兼容, 可用于法医学体液组织来源鉴定 第四、五次 月经血、阴道分泌物 月经血：MMP7、MMP10、MMP11和MSX1、LEFTY2、 SFRP4构成两个复合体系 阴道分泌物：MYOZ1、CYP2B7P1、MUC4和Ljen、Lcris、Lgas构成两个复合体系以及特异性分子HBD1 管家基因：B2M、UBC、UCE 参与联合试验的所有实验室均可从干燥斑痕中检测到mRNA, 且该方法与DNA分型兼容 第六次 皮肤/可接触性样品 皮肤/可接触性样品：skin1 (LCE1C、LCE1D、LCE2D、IL1F7和CCL27), skin2 (LOR、KRT9和CDSN) 管家基因：B2M, UBC, UCE 在使用不同试剂和仪器的前提下, 所有实验室均能在可接触样品（如人类皮肤、手掌印记、指纹、衣物、汽车内饰等）中分离和检测到mRNAs

表4 EDNAP对mRNA分析体系的评估试验 Table 4 Evaluation test on mRNA analytic system by EDNAP