仪器：Thermo-Finnigan PolarisQ离子阱质谱联用仪（配置MS/MS）; HC-3018型离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）; 涡旋器（江苏金坛机械厂）。

试剂：苯胺（99.5%, 沈阳市试剂一厂）; 氯代苄、亚硝酸钠、硫酸铜、盐酸（均为分析纯, 国药集团化学试剂有限公司）; 氰离子标准溶液（100 µ g/mL, 北京坛墨质检科技有限公司）; 空白血为健康人血; 水为去离子水。

色谱条件：色谱柱：DB-5MS(30 m× 0.25 mm i.d. × 0.25 μ m)。程序升温：60 ℃开始, 保持1 min, 以20 ℃/min升至80 ℃, 保持0 min, 以5 ℃/min升至95 ℃, 保持0 min, 以20 ℃/min升至280 ℃。进样口温度：280 ℃。

质谱条件：电子轰击源能量70 eV; 离子源温度200 ℃; 传输线温度280 ℃; 溶剂延迟时间3 min; 一级质谱扫描模式（50~200, m/z）; 二级质谱SRM检测母离子m/z 76（苯甲腈）, m/z 65（氯代苄）。

标准添加血样溶液：临用时在血液中添加氰离子标准溶液, 形成0.1、0.5、1、2、4、8、10 µ g/mL系列浓度的标准浓度血样。

氯代苄内标溶液配制：准确移取23 µ L氯代苄液体用甲醇定容至25 mL, 浓度为1.0 mg/mL。

苯胺衍生化试剂配制：准确移取25 µ L苯胺液体用环己烷定容至25 mL, 浓度为0.15 mol/mL。

NaNO₂溶液配制：准确称取1.25 g NaNO₂固体用去离子水定容至25 mL, 浓度为50 mg/mL。

CuSO₄溶液配制：准确称取0.4 g 无水硫酸铜固体用去离子水定容至25 mL, 浓度为0.1 mol/L。

HCl溶液配制：准确移取52 µ L浓盐酸液体用去离子水定容至25 mL, 浓度为1.0 mol/L。

取血样1 mL, 加5 µ L内标溶液, 涡旋离心。依次加入0.25 mL苯胺衍生化试剂, 0.5 mL NaNO₂溶液, 0.05 mL HCl溶液, 以及0.1 mLCuSO₄溶液, 涡旋混合1 min。放入50 ℃水浴加热15 min。将混合液涡旋后离心, 取有机相1 µ L, 备检。

苯胺衍生化方法为两步衍生化方法, 先由苯胺与亚硝酸盐生成重氮盐, 苯胺与亚硝酸盐的配比直接影响衍生化结果。本文分别考察了苯胺与亚硝酸盐的用量, 当苯胺用量多于亚硝酸盐用量时, 实验效果最佳, 但苯胺用量过大, 衍生化试剂很难除去, 衍生化反应之后剩余的衍生化试剂除去困难或剩余量过大, 进入有机相中的衍生化试剂量也就越多, 色谱本底信号就越强, 对检测造成干扰的可能性就越大。本文对浓度为0.15 mol/mL的苯胺试剂在用量分别为0.05、0.1、0.2、0.25、0.5 mL条件下进行了考查（图1a）, 实验结果表明, 当CuSO₄溶液的用量为0.1 mL, 50 ℃水浴加热15 min后, 加入苯胺试剂0.25 mL以上时, 苯甲腈与氯代苄的定量色谱峰面积之比达到恒定值, 故本文选择苯胺的用量为0.25 mL。硫酸铜作为第二步衍生化反应的催化剂, 不但能有效催化衍生化反应, 也能提高衍生化速度。本文考察了0.02、0.06、0.08、0.1、0.2 mL硫酸铜用量对衍生化反应的影响（图1b）, 研究发现, 使用0.1 mL浓度为0.1 mol/L的CuSO₄溶液, 能达到最佳衍生化效果。由于苯胺衍生化反应需要在酸性条件下进行, 本文考察了酸度对衍生化反应的影响。由于盐酸在第二步衍生化时, 会与氰离子产生竞争, 当盐酸用量过大时, 氰离子很难与重氮盐结合。而盐酸用量过小又会使第一步衍生化很难进行。所以本文对0.01、0.02、0.04、0.05、1 mL盐酸对衍生化反应的影响进行了考察（图1c）, 发现当使用浓度为1 mol/L盐酸溶液0.05 mL时, 衍生化效果最好。

图1

Fig.1

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	图1 衍生化效率的影响（a:试剂; b:催化剂用量; c:酸性试剂用量）Fig.1 The influence on the derivatization（a. reagent; b. catalyst quantity; c.acidic reagent quantity）

本文在选择内标时, 选用氯代苄作为内标, 同时也考察了与苯甲腈结构相近的甲苯、氯苯、溴代苄。但甲苯与提取溶剂环己烷保留时间重叠, 质谱相互干扰; 氯苯是苯基衍生化反应副产物; 溴代苄的保留时间与衍生化中间产物硝基苯的保留时间相同。只有氯代苄与分析物结构性质、色谱行为等相近, 且色谱峰完全分离, 质谱无干扰。所以本文选择氯代苄作为衍生化内标物。

本文所选程序升温在目标峰出峰时间段降低升温速率, 以保证更好地分离目标峰。苯甲腈和氯代苄总离子流色谱和二级质谱表明, 各色谱峰分离良好, 相互之间无干扰, 苯甲腈保留时间4.9 min、氯代苄保留时间5.3 min。

本文选择的母离子为一级质谱的特征离子, 因为一级质谱中特征离子的丰度高, 特征强, 干扰小。苯甲腈和氯代苄的一级质谱特征离子为m/z 103和m/z 91。本文对各衍生物在1.00、1.50和2.00 V激发电压下, 进行二级质谱检测, 结果表明, 当激发电压为1.50 V时, 离子基本解离。在优化好的条件下, 分别得到苯甲腈和氯代苄的二级质谱图（图2）, 其二级质谱特征离子分别为m/z 76和m/z 65。

图2

Fig.2

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	图2 苯甲腈（A）与氯代苄（B）二级质谱图Fig.2 MS/MS spectra of phenyl cyanide (a)/chloride (b)

标准添加血样按1.4项方法操作, 分别记录数据, 以苯胺浓度为横坐标, 以苯胺与氯代苄峰面积比值为纵坐标, 以最小二乘法回归计算, 得到标准曲线回归方程为y=0.335x+0.04, r=0.9980。结果表明, 苯甲腈在此色谱条件下0.1~10 µ g /mL浓度范围内, 线性关系良好, 可以满足毒物分析工作要求。按信噪比3∶ 1确定最低检测限, 最低检测限为0.05 µ g/mL。按信噪比10︰1确定定量限, 定量限为0.18 µ g /mL。

取标准添加血样高、中、低3个浓度（分别为0.1、2、10 µ g/mL）, 按1.4项操作。按实验方法平行操作6次, 结果见表1, 计算平均相对回收率为95%, 日内RSD为4.52%。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 血中衍生化GC/MS/MS分析的精密度和准确性（n=6） Table 1 Recovery and precision of naphthyl derivatives in the tested blood by GC/MS/MS (n=6) CN-添加量/（μ g/mL） 相对回收率/％ 日内RSD/％ 0.1 92.25 5.94 2 95.76 4.47 10 97.99 3.15

表1 血中衍生化GC/MS/MS分析的精密度和准确性（n=6） Table 1 Recovery and precision of naphthyl derivatives in the tested blood by GC/MS/MS (n=6)