正常的人体皮肤是干燥、偏酸性的, 但不同部位的皮肤拥有不同的厚度、褶皱和毛囊皮脂腺分布密度, 因此各部位的皮肤理化性质有些许差异。根据pH值、湿度、皮脂含量、含氧量、温度等生理特性, 皮肤被划分为三大区域：湿润的区域如腋窝、会阴、指间间隙等; 分泌油脂的区域如头部、颈部和躯干等; 以及干燥的区域如四肢皮肤等。

研究表明, 不同区域的微生物群落多样性和丰度不同。油性区域微生物多样性最低, 干性区域最高。丙酸杆菌属在油性部位占有主体地位, 而葡萄球菌属和棒状杆菌属则在潮湿的部位占有主体地位^[2]。病毒和真菌的分布也表现出部位特异性。不同部位的皮肤病毒组差异相当大, 丰度较高的部位是潮湿、褶皱的皮肤部位, 如腘窝和肘窝、脸颊和枕部, 其中腋窝病毒组的多样性最高。人乳头状瘤病毒在皮肤病毒组中丰度最高。此外, 研究同时发现皮肤微生物之间的关系密切, 相互影响, 多数细菌都被同一种噬菌体入侵过, 而细菌群落的分布具有部位特异性, 这一定程度上解释了部分病毒的部位特异性分布^[3]。有研究对人体的14个皮肤部位的真菌群落进行测序, 发现马拉色菌在其中11个部位占优势地位, 而在足部真菌群落呈现高度的多样性。在含有多种细菌的手部, 真菌的种类却相对较少^[4]。可见真菌群落的分布也受皮肤部位的影响。不同部位的皮肤除微生物群落结构组成有差别外, 同一种微生物的菌株水平也有不同, 如表皮葡萄球菌菌株的B亚型相较于其他亚型在足和足趾甲这两个部位更占优势^[5]。

种族、年龄、性别、衣着、卫生习惯等因素造成了不同个体之间具有不同的皮肤微环境。不同的皮肤微环境造就了不同的皮肤微生物群落。年龄对皮肤表面微生物群落影响很大。随着年龄的增长, 皮肤的微环境有很大的变化, 从而对微生物的生长产生影响^{[6, 7]}。通过单独培养的方法, 发现青春期皮脂分泌水平平行于皮肤上亲脂性细菌的水平。性别也造就了不同的微生物群落结构, 研究证实女性的皮肤微生物种类明显多于男性, 这可能是由于男性和女性的皮肤环境如汗液、皮脂和激素产生等方面的生理学和解剖学差异造成的^[8]。不同种族、不同地区的人皮肤微生物群落构成也不同。有研究表明, 与黑种人相比, 白种人鼻上更易生长金黄色葡萄球菌, 更易被链球菌感染^[9]。最新的一项研究对香港的40个健康成年人200个皮肤样本进行泛基因组研究, 同其他种族的研究数据进行对比时发现在微生物群落组成上存在差异, 同时发现同一个皮肤部位的微生物群落组成在不同地理位置同种族间的差别有时比处于同一地理位置的不同种族之间的差别大^[10], 这表明与种族因素相比, 环境因素对微生物群落组成的影响更大, 在实际应用中应该优先考虑环境因素的影响。

外部因素也会改变皮肤微生物的群落结构, 如衣着、紫外线的照射和清洁用品的使用等。如清洁用品的使用会通过清除一些暂住菌群, 减少常驻菌群的数量来改变皮肤微生物的群落结构^[11]。共同居住者的皮肤微生物也是影响因素之一, 有研究表明皮肤微生物菌群可以在家庭成员之间共享, 同时发现一些家庭特异的群落不仅存在于家庭成员的皮肤表面, 还能存在于家中地板、桌面和门把手等物品的表面^{[12, 13]}。Abeles 等^[14]排除了前期研究中血缘因素, 发现无血缘关系的共同居住者皮肤微生物群落间的相似程度远大于有血缘关系的非共同居住者皮肤微生物群落间的相似程度, 而且这些菌群很少受到抗生素等因素的影响。这表明, 家庭成员间能共享一些家庭特异的群落更取决于共同居住这一条件, 而不是血缘因素。

低丰度的微生物和特异性菌株一般具有更好的个体识别能力。研究人员发现发现低丰度的默克尔细胞多瘤病毒具有强烈的个人特征。在对微生物进行全基因测序时, 研究人员发现微生物群落中存在着单核苷酸位点变异（single-nucleotide variants, SNVs）和拷贝数变异（copy-number variations, CNVs）, 这些变异可以用来区分不同宿主的特异性菌株, 研究表明痤疮丙酸杆菌的变异有明显的宿主特异性^[5]。

虽然皮肤微生物群落暴露于外部环境, 其构成受到多种因素的影响, 但是研究人员发现随着时间的推移皮肤微生物群落结构基本上是稳定的。例如手掌表面的微生物在洗手后的数小时就能恢复^[11]。研究人员对12个健康个体的17个皮肤位点进行3个时间点的采样, 采样的时间间隔分别为1~2月和1~2年, 通过衡量3个时间点同一个体同一位置的皮肤微生物样本群落结构的相似程度来探究皮肤微生物群落的时间稳定性, 发现这3个时间点的皮肤微生物群落结构有较高的相似度, 短时间间隔的样本与初始样本的相似度更高。主要的群落特征如多样性和丰度等能在较长的一段时间内保持稳定, 这种稳定性甚至能到菌株水平。皮肤微生物的稳定性与部位有关。皮脂腺区域的细菌和真菌群落的稳定性最大, 而干燥部位的群落相对变化较大。稳定性最差的是足部。研究人员同时对各个部位的微生物群落的物种丰富度和均匀度进行Shannon多样性指数衡量, 发现群落的稳定性与群落多样性呈现负相关。但是皮肤微生物的稳定性也呈现着一定的个体特性。一般而言定植在油性区域的细菌和真菌群落是最稳定的, 但是部分样本个体与其他样本个体相比即使是微生物群落最稳定的皮脂腺区域也存在着较高的变异性^[3]。

皮肤微生物群落结构大体上保持稳定, 那些具有宿主特异性的特征是否也具有一定的时间稳定性呢?研究人员尝试将微生物学同计算机理论结合在一起对微生物群落进行分析, 来探究宿主特异性特征的时间稳定性。Franzosa等^[15]选择了一系列具有宿主特异性和时间稳定性的微生物特征构建成宏基因组代码, 并开发了一种基于碰撞集的算法, 基于代码和算法能够在初始采样时间点的样本中成功区分100个个体。在一年后的比对分析中, 80%来源于粪便的样本能与原宿主进行匹配, 而来源于其他身体部位的样本也有30%的成功率, 且很少发生错配。在此次实验中, Franzosa等人还发现往往基因水平的特征比分类学水平的特征更具有时间稳定性。无独有偶, 有研究人员通过监督学习随机森林法对3个时间点样本中具有宿主特异性的关键分类群的宿主区分能力进行比较, 发现这些关键分类群中一些低丰度的微生物随着时间的变化仍能保持较高的区分能力, 例如默克尔细胞多瘤病毒、阴道加德纳菌和化脓性链球菌。这些微生物随着时间的推移在相对丰度上趋于稳定, 变异系数较低且广泛存在于各个部位皮肤, 有作为微生物DNA指纹进行个人识别的潜力^[3]。

早期, 皮肤微生物的研究主要通过分离培养来实现, 即根据不同的微生物的生长特性设计不同的培养环境, 进而对初次培养生成的菌落利用形态学观察、染色、血清学实验等方法进行鉴别和研究。在实验室特定条件下生长的物种并不一定是取样部位占有支配地位的物种, 不能正确地呈现皮肤微生物群落的原始状态。皮肤微环境构成复杂, 实验室内很难完全模拟。实践证明, 只有少数的细菌能够单独培养。而病毒则需要同细菌和真菌共同培养, 且很难在显微镜下观察。分离培养方法存在严重的偏向性和局限性, 不能全面地、正确地展现出皮肤微生物群落的结构和多样性^[16]。

扩增子测序是一种高靶向性方法, 分析特定基因组区域中的基因变异来反映样品在细菌、真菌、古生菌分类方面物种之间的差异, 对研究微生物群落构成有重要的指导作用, 同时也是系统发育和分类学研究中一种广泛使用的方法。扩增子测序主要包括16S rDNA测序、18S rDNA测序、ITS测序及目标区域扩增子测序等, 其中最常用的是16S rRNA分型技术。16S rRNA 基因是编码原核生物核糖体小亚基的基因, 存在于细菌和古生菌中, 基因序列包括9个可变区和10个保守区, 保守区序列反映了物种间的亲缘关系, 而可变区序列则能体现物种间的差异, 是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。这种方法基于单个序列将样品与已知的微生物分类群进行匹配。

真菌则通常优选16S rRNA基因的内转录间隔区序列（internal transcribed spacer, ITS）来进行检测。UNITE数据库通常用于基于ITS序列的真菌序列分析。此外, 也有研究人员使用18S rRNA、5.8S rRNA和26S rRNA基因测序来对真菌进行分析^[9]。上述通过设计通用引物进行测序的方法, 跟传统的分离培养的方法相比更能揭示更广泛的微生物种群, 但是对测序数据的分析依赖于有限数量的参考基因组, 并需要后续实验的验证。此外需要针对不同的研究目标挑选合适的扩增序列, 例如对古生菌往往使用传统的V4区引物（515F/806R）来进行检测^[17]。对于皮肤菌群来说, V4区靶向测序的分辨率相对较差, Meisel等^[18]通过设计模拟的微生物群落系统地比较了不同的靶向测序结果, 证实了他们先前的猜测即V1-V3区靶向测序在皮肤微生物组研究中有更高的分辨率。

虽然扩增子测序具有技术成熟、数据库丰富等优势, 但并不能完全满足对微生物群落的研究要求, 例如病毒由于缺乏广泛存在的目的基因片段, 因此无法通过设计和扩增目的基因片段来进行研究。因此为实现对微生物群落更加完整全面的研究, 需要选择其他的方法作为补充。

最常用的方法是鸟枪法测序, 该方法提供了更为丰富的微生物群落信息, 有利于将群落作为一个整体来研究, 几乎不受镶嵌性和偏向性的影响, 有利于发现新的微生物种类, 做出准确的系统发育推断, 最终提高人们对微生物群落的认识。Meisel等^[19]设计了模拟群落分别使用鸟枪法测序和扩增子测序来进行微生物群落序列分析, 经过对比发现鸟枪法更接近预期结果, 分辨率较高。

鸟枪法测序虽然具有一定的优点, 但同时也存在着一定的缺陷。鸟枪法测序的实验步骤较多, 制备和储存过程都可能影响最终的分析结果, 因此对于实验人员专业程度提出了较高的要求。样品中微生物DNA含量相对较低时可能会达不到测序的要求, 若想获得足够高的序列覆盖度, 需要更多的经费和更前沿的技术。即使获得了微生物样品的DNA信息, 微生物样本中往往含有大量的宿主DNA信息, 这给后续的数据处理分析带来了巨大的麻烦, 也对生物信息学分析技术提出了要求。除此以外, 参考基因组数据库的丰富度也一定程度上限制了鸟枪法测序的适用范围。近期, 有研究人员在对了解相对较少的微生物群落进行序列分析时将鸟枪法测序和16s rRNA测序的分析结果进行了比较, 得出了与Meisel等人完全相反的结论, 发现一般被认为是优良方法的鸟枪法检测到的多样性比扩增子测序少得多。更有甚者, 在分析淡水细菌时鸟枪法出现了丢失整个门的情况^[20]。这说明在特定环境下, 当鸟枪法测序可用的参考基因组数据较少时, 其测序结果不能准确地反映微生物群落的实际情况。

不同的实验方法各自存在着优缺点, 而方法的选择直接影响到最后对群落的分析结果。随着时代的发展技术也在飞速的发展中, 因此在对微生物群落进行研究时应根据实际情况选择合适的方法, 同时有条件的情况下可多选择几种技术进行相互验证以求获得更加准确的结果。

皮肤表面的微生物具有较高的宿主特异性、部位特异性和时间稳定性, 可通过触摸传递到物体上, 并能在环境中稳定保持较长的时间^[21], 这为其应用于“ 以物找人” 提供了可能。早期有法医学者使用脉冲凝胶电泳法尝试通过微生物DNA指纹来对指纹样本进行同一性认定, 但是结果并不如人意, 凝胶电泳法的分辨率过低, 无法进行准确的判断^[22]。同年, Fierer等^[21]选择了16S rRNA基因测序的方法比对物体和皮肤上的微生物样本, 能较准确地将物体与个相匹配。近期, Schmedes等^[23]建立了一种新的方法, 即通过比较痤疮丙酸杆菌泛基因组结构变异和分支特异性标记的核苷酸多样性特征来对供体的微生物进行分类。实验中, 研究人员在2年半内3个时间点对12个健康个体皮肤的14个位置进行采样, 应用机器学习的方法来对测序结果进行分析, 其中3个位置的分析结果的个人识别准确率高达100%。后又在此基础上构建了hidSkinPlex靶向测序试剂盒, 包含了来源于22种细菌和噬菌体的268个进化支特异性标记。实验中该试剂盒不仅能较准确地将样本联系到宿主, 甚至能较准确地判断出样本的来源部位^[24]。

除了对样本和宿主进行同一性认定外, 皮肤微生物的宿主特异性等特点也使其具有指明侦查方向的功能。有研究表明, 通过对教室桌椅上留下的皮肤微生物进行鉴定可以较准确地判断出桌椅主人的性别^[25]。分析不同个体的皮肤微生物群落结构能判断他们是否有共同居住的情况^[12]。此外, 人员和居住环境的微生物分析结果也可用于判断近期房间内有无外人进入和嫌疑人是否在该房间内长期居住。

微生物在尸体腐败进程中起到了重要的作用。有学者尝试通过皮肤微生物群落来估测死亡时间, 通过机器学习的方法开发了一个k近邻回归器, 通过对来自尸体鼻和耳皮肤微生物样本群落结构随时间变化的数据集进行归纳分析, 总结规律用以测算未知样本的死亡时间。虽然该方法使用时仍存在较大误差, 但这是利用皮肤微生物预测死亡时间的一种新的尝试, 为后续的研究提供了思路^{[26, 27]}。

虽然皮肤微生物应用于法医学在实验阶段已经有较大的突破, 但是在实际应用中仍存在一定的问题。

前期研究表明个体在物体表面留下可识别的微生物痕迹持续时间能达2周, 但在实际案件中痕迹的遗留时间是无法预知和无法控制的。与静态的指纹不同, 遗留的微生物痕迹随着时间的变化而变化。研究人员历时四个季节跟踪分析家庭成员皮肤微生物群和家庭物品表面微生物群, 以确定是否可以在延迟取样的情况下实现个体与家庭的精确微生物群匹配, 发现当皮肤和家庭物品表面微生物样本在不同季节提取时, 尤其是当表面样本在皮肤样本提取之后很长时间再提取时, 匹配准确性会大大降低。大多数操作分类单元（operational taxonomic units, OTU）在皮肤或物品表面上稳定存在的时间小于一个季度, 这表明OTU损失是导致匹配精度下降的主要原因。而对个体识别更有用的OTU持续时间较短, 并且可能会以优先擦除可用于识别个体的特征的方式降解^[28]。宿主特异性微生物特征在脱离宿主后稳定性变差。案发后随着时间的推移, 案发现场物品表面提取的皮肤微生物样本证据效力不断地降低, 提取的微生物样本能作为证据使用的时间临界点需要在后续的研究中进一步地研究认定。

虽然人体的皮肤微生物群落大致是稳定的, 但是前期研究的样本来源均比较理想。而在现实应用中往往会出现各种不同的情况, 举个极端例子, 例如原本在A城市长期居住的嫌疑人在犯罪时留下的微生物群落与被逮捕时已经在B城市逃亡很久突发皮肤疾病的嫌疑人身上取下的微生物样本是否还能进行同一性认定, 这需要在今后的实验中进一步进行验证。与此同时, 我们也应该进一步探寻更加稳定的微生物标记来用于同一性认定的检验鉴定。

按以往经验, 很多犯罪嫌疑人往往与犯罪现场的物体表面仅有一次或几次的接触, 次数远小于该物体的经常接触者例如屋子的居住者、物品的经常使用者的接触次数, 与此相对应, 残留在物体表面的微生物中来源于犯罪嫌疑人的组分往往占比较小, 甚至还有更为复杂的二次转移问题, 这为检材提取和后续分析带来了巨大的困难, 需要探求能尽量多地提取到犯罪嫌疑人的皮肤微生物群落的提取技术和将两个甚至多个接触者的微生物群落区分开的后续分析方法。

皮肤微生物的实验分析结果要应用于法庭科学领域, 需具有可靠性、重复性。由于微生物无处不在, 在样本采集、保存、运输、检验过程中如何防止外界微生物污染和本底微生物随时间变化, 确保实验结果的可靠性和重复性也是法医工作者需要解决的难题。