引用本文
田芳, 王旭, 王顺霞, 张庆霞, 焦章平, 路志勇. 同步扩增常染色体和Y染色体STR SureID® Compass试剂盒性能测试分析 [J].刑事技术, 2019,44(2):175-179
TIAN Fang, WANG Xu, WANG Shunxia, ZHANG Qingxia, JIAO Zhangping, LU Zhiyong. Performance for SureID® Compass Kit Synchronizing Amplification of Autosomal and Y Chromosomal STRs [J]. Forensic Science and Technology,2019,44(2): 175-179  
Doi: 10.16467/j.1008-3650.2019.02.019
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同步扩增常染色体和Y染色体STR SureID® Compass试剂盒性能测试分析
田芳1, 王旭2, 王顺霞2, 张庆霞2, 焦章平2, 路志勇2,*
1.北京市石景山区公安司法鉴定中心,北京 100043
2.北京市公安司法鉴定中心,北京 100192
* 通讯作者：路志勇,男,山东德州人,硕士,副主任法医师,研究方向为法医物证学检验。E-mail：luzhiyong2431@163.com

第一作者简介：田芳,女,安徽黄山人,学士,主检法医师,研究方向为法医物证学检验。E-mail：478125487@qq.com

摘要

目的 研究SureID® Compass试剂盒性能指标,建立适合其特点的测试方案。方法 选择合适的DNA标准物质,从标准品灵敏度、混合样本、种属特异性、不同检材适应性、降解样本和含抑制剂样本的耐受性、不同仪器间一致性、峰值均衡性、反复冻融稳定性等8个方面对试剂盒进行测试。结果 经检测,SureID® Compass试剂盒灵敏度较高,对混合样本、酶切降解以及含抑制剂的样品具有一定的检验能力,种属特异性、适应性和峰值均衡性也均较好,所选择的DNA标准物质适用于该试剂盒测试。结论 本测试方案适用于同步扩增常染色体和Y染色体STR试剂盒的性能指标测试。

关键词: 法医遗传学; SureID® Compass试剂盒; 确证实验; 阳性对照; 标准物质
中图分类号:DF795.2 文献标志码:B 文章编号:1008-3650(2019)02-0175-05
Performance for SureID® Compass Kit Synchronizing Amplification of Autosomal and Y Chromosomal STRs
TIAN Fang1, WANG Xu2, WANG Shunxia2, ZHANG Qingxia2, JIAO Zhangping2, LU Zhiyong2,*
1. Forensic Science Service of Shijingshan Branch of Beijing Public Security Bureau, Beijing 100043, China
2. Forensic Science Service of Beijing Public Security Bureau, Beijing 100192, China
Abstract

Objective To test the technical parameters of SureID® Compass Amplification Kit by establishing an adaptive performance testing procedure.Methods The kit was validated with the selected adaptive DNA reference materials on the items of sensitivity, mixed samples, species specificity, adaptability, survivability, consistency, peak height balance and stability.Results SureID®Compass Kit is adaptive to the mixed, degraded and inhibited samples, shown of high sensitivity. It is also appropriate with the items of species specificity, adaptability and peak height balance. The selected DNA reference materials are suitable to this test and the kit.Conclusions The performance-testing procedure established here is applicable to verify an eligible kit for its synchronizing amplification of autosomal and Y chromosomal STRs.

Key words: forensic genetics; SureID® Compass Amplification Kit; validation; positive control; reference materials

SureID® Compass试剂盒是一款六色荧光复合扩增试剂盒, 该试剂盒整合了15个常染色体STR基因座、1个性染色体Amelogenin基因座、1个Y染色体插入缺失Y-indel以及16个Y染色体STR基因座, 可以同步检测常染色体及Y染色体的STR分型, 适合于混合斑（比如男女混合）样本的检验。本文建立的实验方法参照常染色体STR试剂盒检测方案并做了改良, 使之更适合于所测试剂盒的特点, 且又同时符合国际公认的确证试验指南和国家标准要求[1], 故检测结论应更具有说服力和公正性。

1 材料与方法
1.1 仪器及试剂

7500型定量PCR仪、9700型扩增仪、3130xL型测序仪、3500xL型测序仪、Quantifiler® Trio DNA Quantification Kit（美国Applied Biosystems公司）。SureID® Compass试剂盒（宁波海尔施基因科技有限公司）, 其基因座排列见图1。

图1 SureID® Compass试剂盒基因座排列形式Fig.1 The arrangement of STR loci of SureID® Compass Kit

1.2 样品

DNA标准物质007（美国Applied Biosystems公司）、9948（美国Promega公司）[2]; 马、狗、猪、牛、羊、猫、鸡、鸭、鼠、兔、鱼等11种常见动物DNA（中国检验检疫科学研究院）; 大肠杆菌DNA（中国科学院微生物研究所）。

1.3 DNA定量及扩增

按照Quantifiler® Trio DNA Quantification Kit及7500定量PCR仪操作手册对DNA标准物质007和9948进行定量, 007制备成1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625 ng/μ L的标准品; 9948则是1.0 ng/μ L。常见动物DNA的浓度由中国检验检疫科学研究院进行定量, 大肠杆菌DNA的浓度由中国科学院微生物研究所定量, 制成1.0 ng/μ L的动物DNA及1.0 ng/μ L的大肠杆菌DNA。PCR反应体系为10 μ L, 其中含5 μ L Master Mix, 2.5 μ L Primer, 1 μ L DNA, 1.5 μ L去离子水, 热循环参数：95 ℃、5 min; 94 ℃、10 s, 61 ℃、1 min, 70 ℃、30 s, 28 cycles; 60 ℃、15 min; 4 ℃保存。产物经3130xL及3500xL型测序仪检测, Genemapper ID-X分析。

1.4 试剂性能测试

1.4.1 标准品灵敏度

采用定量的007标准品, 以1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625 ng的模板量进行扩增、检测。

1.4.2 混合样本

将浓度为1.0 ng/μ L的007标准品和9948标准品以19︰1、18︰2、16︰4、14︰6、12︰8、10︰10、8︰12、6︰14、4︰16、2︰18、1︰19的比例混合均匀, 各取1 μ L进行扩增、检测。

1.4.3 种属特异性

将浓度为1.0 ng/μ L的马、狗、猪、牛、羊、猫、鸡、鸭、鼠、兔、鱼等11种常见动物DNA和大肠杆菌DNA, 各取1 μ L进行扩增、检测。

1.4.4 不同检材适应性

取已知分型的血斑、精斑、唾液斑、脱落细胞、组织、软骨、毛发（含毛囊）各2份, 按《法庭科学DNA实验室检验规范（GA/T 383-2014）》规定的标准方法提取DNA, 各取1 μ L进行扩增、检测。

1.4.5 降解样本和含抑制剂样本耐受性

降解：取17 μ L浓度为1.0 ng/μ L 9948标准品、1 μ L Alu Ⅰ DNA内切酶、2 μ L BSA、3μ L酶切缓冲液混匀后, 37 ℃孵育60 min; 再加入1 μ L Hae Ⅲ DNA内切酶、2 μ L酶切缓冲液混匀, 再37 ℃孵育60 min。酶切完成后, 用QIAquick® PCR纯化试剂盒（德国Qiagen公司）浓缩到10 μ L, 取1 μ L进行扩增、检测。

抑制剂：1）靛蓝：240 mmol/L 靛蓝与1.0 ng/μ L 9948标准品等量混合, 取1μ L进行扩增、检测; 2）血红素：在1.0 ng 9948标准品PCR反应体系中加入血红素, 使其最终浓度达到5、10、20、40 μ mol/L。

1.4.6 不同仪器间一致性

取已知分型的血斑、精斑、脱落细胞、软骨、毛发, 按GA/T 383-2014中标准方法提取DNA, 在不同扩增仪上分别扩增, 3130xL和3500xL型测序仪上分别检测、分析。

1.4.7 峰值均衡性

观察9948标准品分型结果与说明书是否一致, 计算其峰值均衡性。在常染色体STR基因座, 杂合子以低峰与高峰的峰高比值为本基因座等位基因之间的峰值均衡性。在同一荧光中, 杂合子峰高值取平均值, 纯合子峰高值除以2, 以最低峰与最高峰的峰高比值作为该荧光中不同基因座之间的峰值均衡性。对于Y-STR基因座, 因其分型均为单倍型, 因此采用同一荧光中最低峰与最高峰的峰高比值作为该荧光中不同基因座之间的峰值均衡性。在不同荧光组之间进行比较时, 取每色荧光中所有基因座的峰高均值, 以最低峰与最高峰的峰高比值作为该试剂盒不同荧光之间的峰值均衡性。

1.4.8 反复冻融稳定性

将该试剂盒中所有组分反复冻融, 每次冻融后即进行扩增、检测, 共进行20次。

2 结果
2.1 标准品灵敏度

不同模板量的007标准品经检测, 0.125 ng及以上浓度的标准品均可获得完整分型, 峰值均衡性较好, 而0.0625 ng标准品的RFU值较低, 峰值不均衡。表明该试剂盒的灵敏度可达0.125 ng, 符合《法庭科学人类荧光标记STR复合扩增检测试剂质量基本要求（GA/T 815-2009）》。结果见图2、图3。

图2 SureID® Compass试剂盒0.125 ng 007标准品分型结果Fig.2 SureID® Compass Kit to unveil the STRs of control DNA 007 at the concentration of 0.125ng

图3 SureID® Compass试剂盒0.0625 ng 007标准品分型结果Fig.3 SureID® Compass Kit to expose the STRs of control DNA 007 at the concentration of 0.0625ng

2.2 混合样本

浓度均为1.0 ng/μ L 007标准品和9948标准品按既定比例混合后, 在16︰4与4︰16之间所有的混合样本均可以准确分型, 满足GA/T 815-2009标准的要求。结果见图4。

图4 9948和007为16∶ 4的混合比例分型结果Fig.4 STR typing from the mixture of control DNA 9948 and 007 at the ratio of 16:4

2.3 种属特异性

马、狗、猪、牛、羊、猫、鸡、鸭、鼠、兔、鱼等11种常见动物DNA和大肠杆菌DNA均未显现分型结果, 满足GA/T 815-2009标准要求。

2.4 不同检材适应性

血斑、精斑、唾液斑、脱落细胞、组织、软骨、毛发（含毛囊）等各类案件中常见检材DNA均获得完整、正确的分型结果, 满足GA/T 815-2009标准要求。

2.5 降解样本和含抑制剂样本耐受性

模拟降解样本, 在TH01、DYS458、D16S539、D2S1338、TPOX、DYS456、DYS390、DYS392、DYS385基因座未检出基因分型, 在DYS439、DYS389Ⅱ 、DYS19、D8S1179、FGA基因座检出基因分型的峰高显著低于其余基因座, 在D19S433基因座等位基因峰高不平衡。一定含量抑制剂（如靛蓝和血红素）的样本均能得到完整的STR基因座分型, 满足GA/T 815-2009标准要求。结果见图5~7。

图5 9948标准品制作的降解样本分型结果Fig.5 STR typing of the degraded sample made with control DNA 9948

图6 9948标准品含抑制剂（靛蓝）分型结果Fig.6 STR typing of control DNA 9948 containing inhibitor (indigotin)

图7 9948标准品含抑制剂（血红素40μ mol/L）分型结果Fig.7 STR typing of control DNA 9948 containing the inhibitor of heme (40μ mol/L)

2.6 不同仪器间一致性

不同类型的检材DNA经不同扩增仪和遗传测序仪检测, 结果无差异, 满足GA/T 815-2009标准要求。

2.7 峰值均衡性

9948标准品不同STR基因座等位基因之间的峰值均衡性≥ 80.9%, 同一荧光中不同基因座之间的峰值均衡性≥ 51.2%, 不同荧光组之间的峰值均衡性≥ 65.6%, 满足GA/T 815-2009标准要求。结果见表1。

表1 峰值均衡性计算表 Table 1 The peak balance by calculation
2.8 反复冻融稳定性

该试剂盒所有组分经反复冻融20次, 结果无差异, 满足GA/T 815-2009标准要求。

3 讨论

本研究显示, SureID® Compass试剂盒的性能测试方案采用与一般常染色体STR试剂盒相同的测试项目, 但具体方法稍做调整, 对阳性对照和混合样本的选择以及峰值均衡性的计算等也做相应改变, 最终所得认证结论是合乎标准要求的。此前已通过DNA试剂认证的20多个检测单元均为常染色体STR的试剂盒, 关于其测试方案, 认证检测管理部门对标准品的灵敏度、混合样本、种属特异性、不同检材的适应性、降解样本和含抑制剂样本的耐受性、一致性、峰值均衡性以及反复冻融稳定性等方面都有明确规定, 并据此形成了固定、统一的操作方案[3]。如根据试剂盒能检出9947A全部基因座时的最低浓度作为该试剂盒的灵敏度, 同时以9947A的峰高比例确定试剂盒的均衡性; 在测定试剂盒对混合样本的检测、分析能力时, 用9947A和9948进行混合, 如果两者比例在1︰4和4︰1之间全部基因座能够检出, 则满足要求。上述方案对常染色体STR试剂盒适用, 而对于含有性染色体STR基因座的试剂盒, 在检测时则存在一些问题, 因Y-STR试剂盒无法选用9947A。本研究检测的试剂盒中有两种荧光组均为Y-STR基因座, 如果阳性对照选择9947A, 则这两种荧光组没有分型结果, 因而既无法计算均衡性又不能分析男女混合样本, 因而也就不能反映所测试剂盒可同步检测常染色体及Y染色体STR的特点。因此, 本实验在方案设计之初, 就选择了同为男性DNA的007和9948作为标准物质, 以解决上述问题。

本测试的不足之处在于制作酶切降解样本过程中, 根据相关检测细则和测试方案[3], 使用了Ⅱ 型DNA内切酶Alu Ⅰ 和Hae Ⅲ , 但该类内切酶的识别与切割位置是DNA链上特定的核苷酸顺序, Alu Ⅰ 的酶切位点为AG|CT, Hae Ⅲ 是GG|CC, 酶切后产生特异性的DNA片段。所模拟降解样本的检测结果, 确实也观察到了相关基因座无扩增产物、基因座间扩增不平衡、等位基因间扩增不平衡等现象, 但这却并不符合自然降解检材基因座扩增子越长降解就会越严重或更随机而致上述现象发生的规律, 原因在于模拟样本是9948标准品的Alu Ⅰ 和Hae Ⅲ 酶切产物, 如此则位于SureID® Compass试剂盒相关基因座的上下游引物之间或引物结合区的酶切位点及酶切程度, 会使所涉及基因座的扩增结果所反映的或并不是真实发生的降解情况。

本研究说明, 检测试剂盒性能特征需结合其本身特点选择并制定出合理的检测方案。GA/T 815-2009标准自发布实施以来, 对推动我国DNA检测试剂的发展起了重要作用, 但由于DNA技术发展迅速, 该标准并不能达到完全覆盖。故笔者建议在以后标准更新过程中, 应对检测项目进行更加深入的研究, 最大限度模拟自然界中实际存在的DNA降解和抑制PCR扩增等相类似的情况, 在种属特异性样本的选择上则可考虑能否增加高级灵长类动物的DNA, 同时针对各种不同类型试剂盒的适用性问题, 增加诸如直扩试剂盒[4]、性染色体试剂盒[5, 6]、动物类STR试剂盒[7]的检测条款, 甚至也要考虑到基于mt-DNA和下一代测序技术（NGS）试剂盒的检测标准问题, 使其更加适应新技术, 更好地推动我国法医DNA领域的快速发展。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。

参考文献
[1] SCIENTIFIC WORKING GROUP ON DNA ANALYSIS METHODS (SWGDAM). revised validation guidelines [EB/OL](2014-04-21)[2017-08-02]. http://www.fbi.gov/about-us/lab/forensic-science-communitions/fsc/july2000/codispre.htm/codis2a.htm. [本文引用:1]
[2] 赵兴春, 印佳, 孙敬, 等. 美国法庭科学DNA标准物质[J]. 中国法医学杂志, 2009, 24(4): 263-266. [本文引用:1]
[3] 路志勇, 薛卢艳, 张庆霞, 等. GlobalFiler® PCR扩增试剂盒验证及其STR遗传多态性[J]. 法医学杂志, 2015, 31(4): 273-276. [本文引用:2]
[4] 白雪, 姜成涛, 赵兴春, 等. DNA TyperTM 15 plus直扩试剂盒在DNA数据库建设中的应用[J]. 中国法医学杂志, 2012, 27(5): 372-375. [本文引用:1]
[5] 刘秋玲, 吕德坚, 赵虎. X染色体STR荧光复合扩增体系的建立及其应用[J]. 法医学杂志, 2009, 25(6): 425-427. [本文引用:1]
[6] 朱传红, 周翔, 邵毅, 等. 湖北地区汉族人群24个Y-STR基因座遗传多态性研究[J]. 刑事技术, 2014, 39(1): 16-22. [本文引用:1]
[7] 叶俊华, 杜蔚安, 杨前勇, 等. 犬17A STR 5色荧光检测试剂盒在警犬DNA鉴定中的应用研究[J]. 刑事技术, 2011(2): 11-13. [本文引用:1]