国产DNA检测设备在高海拔环境的应用
[才四芳1 
, 丁小仙1 , 王占海2 , 李英3, * , 吴边3 ]
, 丁小仙, 吴边引用本文
才四芳, 丁小仙, 王占海, 李英, 吴边. 国产DNA检测设备在高海拔环境的应用[J].刑事技术, 2019,44(1):83-86
CAI Sifang, DING Xiaoxian, WANG Zhanhai, LI Ying, WU Bian. High-altitude Applicability Test for China-made DNA Detection Devices[J]. Forensic Science and Technology,2019,44(1): 83-86
doi: 10.16467/j.1008-3650.2019.01.017
CAI Sifang, DING Xiaoxian, WANG Zhanhai, LI Ying, WU Bian. High-altitude Applicability Test for China-made DNA Detection Devices[J]. Forensic Science and Technology,2019,44(1): 83-86
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国产DNA检测设备在高海拔环境的应用
第一作者简介：才四芳（1965—）,女,青海玉树人,学士,主检法医师,研究方向为法医物证学。 E-mail: caisifangqinghai@126.com
摘要
本文利用国产DNA检测设备（包括核酸自动提取仪、基因扩增仪及遗传分析仪）在高海拔环境进行DNA检测,研究在西部高海拔地区建立DNA实验室的可行性,以及对不同实验方法进行比较分析。结果表明国产DNA检测设备可以满足高海拔使用要求,常规检材无需经过特殊处理即可获得满意的分型结果,接触类检材通过扩增前覆盖石蜡油进行保温密封等方法也能提高检出率。
关键词:
国产DNA检测设备; 高海拔; 常规检材; 接触类检材
中图分类号:DF795.2
文献标志码:B
文章编号:1008-3650(2019)01-0083-04
High-altitude Applicability Test for China-made DNA Detection Devices
Abstract
The high-altitude feasibility was tested of China-made DNA detection devices to equip into the DNA laboratories in west plateau of China. All of the China-made apparatus, including DNA extraction instrument, PCR thermal cycler and DNA analyzer, were experimented with different test choices in high altitude laboratories. The results showed that the China-made DNA detection devices can meet the requirements of high altitude, having left satisfactory genotyping results from common biological samples with no need of special handling although the touch DNA samples will be improved of their detectability when sealed with paraffin oil before PCR amplification.
Key words:
China-made DNA detection devices; high-altitude experiments; common biological samples; touch DNA samples
基于PCR扩增与STR分型的DNA检测技术已成为法医DNA实验室的常规分析手段, 在案件侦破和DNA数据库建设中发挥着重要作用。我国西部很多地区海拔高、交通不便, 检材送检费时费力, 故一些地方迫切需要建立DNA实验室。但在西部高海拔地区建立DNA实验室需要解决两个问题, 一是西部地区经济基础较差, 无法承受外国产仪器耗材高昂的费用; 二是高海拔环境给DNA检测各个环节带来的不利影响需解决。
采用国产仪器设备可有效解决地方经费不足的问题。随着我国精密制造业水平的快速提升, 国产DNA仪器设备在性能指标、可靠性等方面都已接近或达到国外产品同等技术水平, 而价格却远低于国外产品。高海拔环境给DNA检测环节带来的不利影响主要有两个方面：一是造成液体沸点的降低, 海拔每升高300 m, 水的沸点就降低1 ℃, 海拔4000 m水的沸点约为87 ℃, 在PCR扩增体系中, 反应物均是水溶液且需要反复加热到90 ℃以上, 极易造成反应物沸腾、气化, 给实验结果带来不利影响; 二是高海拔对仪器设备的使用要求更苛刻, 国家标准规定, 低压电气设备使用的海拔高度为2000 m以下[1], 超过2000 m使用的产品应进行专门设计或通过更为苛刻的测试, 高海拔主要影响仪器设备的绝缘强度、电气间隙、散热性能等, 会造成仪器设备工作不稳定或精度降低, 应对此进行专门设计, 例如我国青藏铁路（最高海拔5100 m）使用的机车就针对高海拔环境进行了专门处理[2]。目前资料可查证, 我国开展DNA检测的最高海拔地区是拉萨市[3]（3658 m）, 而国外亦无更高海拔的实验记录。
本文采用国产仪器设备, 主要包括核酸自动提取仪、PCR扩增仪、遗传分析仪等, 分别在海拔3820 m的玉树州结古镇和4230 m的曲麻莱县进行DNA检测实验, 测试国产仪器设备的准确性和稳定性, 以期为高海拔地区建立DNA实验室提供科学依据和实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
随机选取13份实际样本, 其中血样2份, 毛发1份, 烟蒂4枚, 口腔拭子1个, 胶带粘取物 5份（分别取自门把手、手机、照相机、相框、桌面粘取物）。
1.2 试剂耗材
长春博坤生物科技有限公司生产的ML-超微量磁珠法DNA提取试剂盒BK-ML-48-11和案件专用磁珠法DNA提取试剂盒BK-AK-48; PowerPlex21 System扩增试剂盒（美国Promega公司）; 毛细管电泳凝胶（公安部物证鉴定中心）。
1.3 主要仪器
KingFisher核酸自动提取仪（长春博坤生物科技有限公司）; Hema9700梯度基因扩增仪（珠海黑马医学仪器有限公司）; GA118-16A遗传分析仪（公安部第一研究所）。
1.4 仪器准备
所有仪器均进行通电开机自检, 在GA118-16A遗传分析仪上安装毛细管, 水洗注胶泵后换上凝胶, 运行空间校正, 再以PowerPlex 5C Matrix进行仪器光谱校正。
1.5 实验方法
1.5.1 DNA提取
针对不同类型检材进行前处理, 按核酸自动提取仪纯化程序, 将血样、毛发、烟蒂及口腔拭子加入400 µ L裂解液, 在恒温混匀仪上95 ℃（为防止沸腾加入40 µ L石蜡油覆盖）裂解45 min, 胶带剪成小块后加入240 µ L消化液, 56 ℃（因温度较低未做处理）孵育60 min, 随后分别运行自动化提取程序进行DNA提取, 其中胶带粘取物采用超微量磁珠法DNA提取试剂盒, 其余样本采用案件专用磁珠法DNA提取试剂盒。
1.5.2 PCR扩增
将提取的13份DNA模板分为三组, 采用Hema9700梯度基因扩增仪、PowerPlex21 System扩增试剂对提取的DNA进行统一扩增, 其中第1、2组样品在扩增前分别加10、40 µ L石蜡油进行保温覆盖, 第3组不加石蜡油正常密封, 分组情况如表1所示。
 | 表1 样本分组 Table 1 Sample grouping |
采用经青海省公安厅DNA实验室确认的10 µ L扩增体系参数对国产仪器进行测试, 各样本反应体积如表2所示。
| 表2 PCR反应体系 Table 2 PCR reaction constituents |
PCR反应条件如表3所示, 不同类型检材按同一扩增条件进行扩增。
| 表3 PCR反应参数 Table 3 PCR parameters |
2 结果
三组PCR扩增产物转移至GA118-16A遗传分析仪上进行电泳, STR分型结果采用GeneMapper ID-X进行分析（分析阈值50RFU）, 检出情况如表4所示, 采用石蜡油覆盖的第1组和第2组检出情况相同, 均高于未进行覆盖的第3组, 具体实验结果分析如下：
| 表4 各组样本DNA检出结果 Table 4 Detection results of each sample group |
1）三组样本的Ladder、阳阴性对照均正常无差异, 表明仪器、试剂功能正常, 样本未发生污染;
2）有三个样本（烟蒂3、手机粘取物、相机粘取物）在三组产物中均未获得足够的基因座分型（5个以下）, 可判定扩增前的DNA模板量不足, 未收集到足够的脱落细胞;
3）对于全部检出的样本, 三种扩增方法没有明显区别, 均可获得完整有效的STR分型, 且分型结果一致;
4）对于胶带粘取收集的脱落细胞, 第1、2组的扩增效果要明显优于第3组。5份粘取物中第1组有2份得到完整分型, 1份得到10个以上基因座分型, 2份未检出。第2组有1份得到完整分型, 2份得到10个以上基因座分型, 2份未检出。第3组仅有1份得到10个以上基因座分型, 4份未检出。图1~图3分别为门把手上的脱落细胞在三组中的分型图谱, 第1、2组中均得到完整有效的基因分型, 第3组中只得到部分基因座分型, 有部分基因座如Amel、Penta E、TPOX等扩增不完整或未扩增出来。
 | 图1 第1组中的门把手脱落细胞Fig.1 STR profile of exfoliated cells on the door handle of group 1 |
 | 图2 第2组中的门把手脱落细胞Fig.2 STR profile of exfoliated cells on the door handle of group 2 |
 | 图3 第3组中的门把手脱落细胞Fig.3 STR profile of exfoliated cells on the door handle of group 3 |
5）同样是覆盖石蜡油, 第1组的扩增效果要稍优于第2组, 图4~图6分别为桌面脱落细胞（疑似混合检材）在三组中的分型图谱, 第1组得到的有效基因分型数、峰高、峰型要好于第2组, 第3组完全没有得到有效分型。
 | 图4 第1组中的桌面脱落细胞Fig.4 STR profile of exfoliated cells on the table-top of group 1 |
 | 图5 第2组中的桌面脱落细胞Fig.5 STR profile of exfoliated cells on the table-top of group 2 |
 | 图6 第3组中的桌面脱落细胞Fig.6 STR profile of exfoliated cells on the table-top of group 3 |
3 讨论
该套国产DNA仪器设备在随后移至曲麻莱县（海拔4230 m）的重复性实验中得到类似结果：对于血样等常规检材, 在高海拔进行PCR扩增无需经过特殊处理也可得到满意的分型结果; 对于接触DNA[4], 在进行PCR扩增时覆盖同等体积的石蜡油可得到较好的扩增效果, 能有效提高疑难检材的检出成功率。虽然本文采用的Hema9700基因扩增仪具备热盖, 可有效防止反应液的蒸发, 但由于高海拔造成的液体沸点降低, 沸腾后的反应液无法继续升温, 会导致PCR扩增失败或不充分, 采用石蜡油进行密封保温可防止反应液过早沸腾, 顺利达到变性温度。至于采用40 µ L石蜡油的密封效果反而不如10 µ L, 笔者认为主要是反应体积过大（总体积50 µ L）而变性时间过短（10 s）所致。文中采用的PCR反应参数源于PowerPlex21 System试剂盒说明书（针对25 µ L体系）, 反应体积小于25 µ L不会造成影响, 若反应体积增加1倍, 则反应液升温需要更长的时间从热块吸收更多的热量才能达到设定温度, 因此适当延长变性时间将会改善扩增效果。本文检测样本数量较少, 没有进行更深入研究, 若能针对不同类型检材在扩增过程中的参数如温度、时间、循环数等进一步优化, 则应能取得更好的实验结果。在前后几天的实验过程中国产仪器设备经过200多千米的运输, 未发生任何异常故障。后期青海省黄南州、果洛州新建的DNA实验室均采用了本文所用的国产DNA仪器设备。目前使用时间已超3个月, 仪器均运行稳定, 性能可靠, 可以满足高海拔环境的使用要求[5]。
参考文献
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