无水乙醇, 叔丁醇, 均为色谱纯, 购自长沙市化玻公司。

乙醇对照品标准溶液：乙醇质量浓度分别为0.10、0.20、0.50、0.80、1.00、2.00、3.00 mg/mL的对照品标准品溶液, 购自司法部司法鉴定科学技术研究所, 置4 ℃冰箱冷藏保存。

叔丁醇标准品溶液的制备：精密称取502.5 mg叔丁醇（含量99.5%, 色谱纯）于100 mL容量瓶中, 加重蒸馏水至刻度, 混匀, 得5.0 mg/mL叔丁醇对照品标准储备液。将此储备液用重蒸馏水稀释125倍, 得40.0 μ g/mL叔丁醇内标工作液。

实验用白酒：酒中酒霸（浓香型, 酒精度45%）, 购自超市。

一次性使用真空采血管：枸缘酸钠（1∶ 4）管、枸缘酸钠（1∶ 9）管、EDTA-K2管均为2 mL规格（此三种采血管均为抗凝管）, 无抗凝剂管、促凝剂管、分离胶-促凝剂管均为5 mL规格, 山东省成武县医用制品厂生产。

空白血液为近期未服用药物的正常人血液; 实验用水为重蒸馏水。

顶空气相色谱仪7890A/G1888, 配有氢火焰离子化检测器（FID）和Agilent气相色谱工作站, 美国安捷仑（Agilent）公司。

1.3.1 志愿者实验

7名男性志愿者, 分成3组。第1组3名, 平均年龄20.3岁, 平均体重61.1 kg, 分别编号为ZYZ101、ZYZ102、ZYZ103; 第2组3名, 平均年龄22岁, 平均体重64.3 kg, 分别编号为ZYZ201、ZYZ202、ZYZ203; 第3组1名（空白对照组）, 年龄21岁, 体重62.0 kg, 编号为ZYZ300。按中国人饮酒习惯, 第1组志愿者按2.0 g/kg体重饮用白酒（折合乙醇质量为0.71g/kg）, ZYZ101、ZYZ102、ZYZ103饮酒量分别为130.0 g、118.6 g、118.0 g; 第2组志愿者按4.0 g/kg体重饮用白酒（折合乙醇质量为1.42 g/kg）, ZYZ201、ZYZ202、ZYZ203饮酒量分别为246.0 g、269.2 g、256.0 g; 第3组志愿者饮酒量为0。

1.3.2 样品采集

志愿者饮酒后2 h, 分别用一次性使用真空采血管枸缘酸钠（1:4）管、枸缘酸钠（1:9）管、EDTA-K2管及无抗凝剂管、促凝剂管、分离胶-促凝剂管等6种不同的采血管采集志愿者血液样品各7份, 置4 ℃冰箱中冷藏保存。

1.3.3 样品处理

取20 mL顶空样品瓶两个, 分别加入40.0 µ g/mL的叔丁醇内标溶液1.000 mL, 再各加入待测血液样品0.200 mL, 用橡胶垫铝帽密封, 混匀, 65 ℃加热5 min, 取1.00 mL液上气体进行顶空气相色谱分析。内标法-校准曲线法定量。

1.3.4 色谱条件

色谱柱DB-ALC1 （30 m× 0.32 mm, 1.8 µ m）石英毛细管柱, 柱温40 ℃; 进样口温度150 ℃, 分流进样（分流比2:1）; 检测器：FID, 温度250 ℃; 载气为高纯氮, 流量5 mL/min, 氢气流量30 mL/min, 空气流量400 mL/min, 尾吹气流量25 mL/min; 加热箱温度65 ℃, 定量环温度105 ℃, 样品瓶加热平衡时间10 min, 样品瓶加压时间0.1 min, 定量环充满时间0.1 min, 定量环平衡时间0.05 min, 传输线温度110℃, 进样时间1 min, 气相循环时间8 min。

用精密移液器分别准确吸取乙醇质量浓度为0.10、0.20、0.50、0.80、1.00、2.00、3.00 mg/mL对照品标准溶液0.200 mL加入顶空样品瓶内, 各加1.000 mL 40.0 µ g/mL叔丁醇内标工作液, 盖上硅橡胶垫、铝帽, 用密封钳加封铝帽, 混匀。按“ 1.3.4” 方法进样检测, 每个浓度样品平行测定2份, 取平均值。以乙醇/叔丁醇色谱峰面积比（Y）对乙醇浓度（X）（mg/mL）进行线性回归, 线性回归方程式为Y=0.9109X – 0.0272（r=0.9999）。

志愿者饮酒后2 h使用不同的采血管采集的血液样品, 分别在第1天（d1）、第3天（d3）、第5天（d5）、第7天（d7）、第9天（d9）、第12天（d12）、第15天（d15）, 按“ 1.3.3” 方法进行样品处理, 按“ 1.3.4” 方法进样检测, 依据线性回归方程计算血液样品中乙醇含量, 每个样品平行测定2份, 取平均值。志愿者血液样品中乙醇含量检测结果见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 志愿者血液样品中乙醇含量（mg/mL）（n=7, X± SD） Table 1 The alcohol concentrations in volunteers’ blood samples (mg/mL) (n=7, X± SD) 采血管种类 ZYZ101 ZYZ102 ZYZ103 ZYZ201 ZYZ202 ZYZ203 无抗凝剂管 0.26± 0.01 0.34± 0.01 0.49± 0.01 0.31± 0.01 0.87± 0.03 0.88± 0.02 促凝剂 0.27± 0.01 0.36± 0.01 0.51± 0.01 0.32± 0.01 0.88± 0.02 0.90± 0.02 分离胶-促凝剂 0.28± 0.01 0.38± 0.02 0.52± 0.01 0.34± 0.01 0.91± 0.03 0.91± 0.02 枸缘酸钠（1:4） 0.19± 0.01 0.26± 0.00 0.37± 0.00 0.22± 0.01 0.64± 0.01 0.66± 0.01 枸缘酸钠（1:9） 0.22± 0.00 0.28± 0.01 0.43± 0.01 0.25± 0.01 0.71± 0.01 0.74± 0.01 EDTA-K2 0.24± 0.01 0.31± 0.01 0.47± 0.01 0.29± 0.01 0.80± 0.01 0.83± 0.01 注：ZYZ300血液样品中未检测出乙醇成分。

表1 志愿者血液样品中乙醇含量（mg/mL）（n=7, X± SD） Table 1 The alcohol concentrations in volunteers’ blood samples (mg/mL) (n=7, X± SD)

取不同采血管包装的志愿者血液样品, 在第1天（d1）按“ 1.3.3” 方法进行样品处理, 按“ 1.3.4” 方法检测, 每个样品平行测定3份, 依据线性回归方程计算血液样品中乙醇含量, 考查其精密度, 结果见表2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 日内精密度（n=3, X± SD） Table 2 Intra-day precision (n=3, X± SD) 采血管种类 ZYZ101 ZYZ102 ZYZ103 ZYZ201 ZYZ202 ZYZ203 无抗凝剂管 0.25± 0.01 0.32± 0.00 0.48± 0.00 0.31± 0.01 0.82± 0.02 0.85± 0.02 促凝剂 0.26± 0.01 0.35± 0.01 0.50± 0.01 0.31± 0.01 0.85± 0.03 0.88± 0.02 分离胶-促凝剂 0.27± 0.01 0.36± 0.01 0.51± 0.02 0.32± 0.02 0.87± 0.02 0.89± 0.03 枸缘酸钠（1:4） 0.19± 0.00 0.26± 0.01 0.36± 0.00 0.21± 0.00 0.63± 0.02 0.64± 0.02 枸缘酸钠（1:9） 0.22± 0.00 0.29± 0.01 0.44± 0.02 0.25± 0.00 0.70± 0.00 0.74± 0.02 EDTA-K2 0.24± 0.00 0.31± 0.01 0.48± 0.01 0.30± 0.01 0.81± 0.02 0.81± 0.00

表2 日内精密度（n=3, X± SD） Table 2 Intra-day precision (n=3, X± SD)

选取某司法鉴定机构15例酒后驾驶认定血液样品中乙醇含量检测案例, 驾驶员血液样品采用一次性使用真空采血管EDTA-K2管包装, 初次检测按“ 1.3.3” 方法进行样品处理, 按“ 1.3.4” 方法进样检测, 依据线性回归方程计算血液样品中乙醇含量, 每个样品平行测定2份, 取平均值。初次检测后的血液样品在-18 ℃冷冻条件下保存60~120 d后仍按初次检测方法进行复核检测。驾驶员血液样品中乙醇含量检测结果见表3。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 驾驶员血液样品中乙醇含量 Table 3 The alcohol concentrations in drivers’ blood samples 案例 编号 保存 时间/d 初次检测 /（mg/mL） 复核检测 /（mg/mL） 平均 /（mg/mL） RSD/% 下降% 1 60 0.98 0.95 0.96 2.46 3.42 2 60 0.09 0.07 0.08 14.94 19.11 3 60 1.90 1.73 1.81 6.48 8.77 4 61 1.76 1.69 1.72 3.05 4.23 5 62 0.41 0.28 0.35 25.36 30.41 6 62 1.73 1.60 1.66 5.52 7.52 7 64 0.11 0.09 0.10 14.38 18.45 8 69 0.30 0.14 0.22 50.75 52.82 9 69 2.14 1.77 1.96 13.32 17.21 10 83 0.74 0.58 0.66 17.54 22.07 11 83 0.44 0.34 0.39 17.84 22.40 12 92 0.49 0.43 0.46 9.83 13.00 13 112 1.10 0.90 1.00 14.13 18.16 14 117 0.05 0.02 0.04 59.75 59.40 15 120 0.26 0.22 0.24 11.09 14.54

表3 驾驶员血液样品中乙醇含量 Table 3 The alcohol concentrations in drivers’ blood samples

实验结果表明, 相同的血液样品采用不同的采血管包装, 血液样品中乙醇含量检测结果不同, 依次为分离胶-促凝剂管> 促凝剂管> 无抗凝剂管> EDTA-K2管> 枸缘酸钠（1:9）管> 枸缘酸钠（1:4）管, 与以往研究结果相同^[1]。

实验结果表明, 用同种类采血管采集的相同血液样品, 分别在第1天（d1）、第3天（d3）、第5天（d5）、第7天（d7）、第9天（d9）、第12天（d12）、第15天（d15）进行检测, 分离胶-促凝剂管、无抗凝剂管、促凝剂管、EDTA-K2管、枸缘酸钠（1∶ 9）管、枸缘酸钠（1∶ 4）管血液样品中乙醇含量d1~d15天RSD分别为3.07%、2.76%、 2.56%、2.47%、2.45%、 2.24%。表明血液样品在冷藏条件下, 检测时间对乙醇含量无明显影响。但实验过程中有3支分离胶-促凝剂管分别在第5天（d5）、第7天（d7）、第9天（d9）出现含量过高（偏离正常值50%以上）的情况, 其原因有待进一步研究。

本实验对司法实践酒后驾驶认定中驾驶员血液样品中乙醇含量进行了复核检测, 分别对15例用一次性使用真空采血管EDTA-K2管采集、且在-18 ℃冷冻条件下保存了60~120天的血液样品进行了检测。检测结果表明：血液样品中乙醇含量均有不同程度的下降, 血液样品中乙醇含量下降比例在3.42%~59.4%, 平均下降20.77%。血液样品中乙醇含量下降比例与血液样品中乙醇含量高低等因素有关, 血液样品中乙醇含量越低, 下降比例越大。且随着血液样品中乙醇含量的降低, 血液样品中乙醛含量明显增高, 或许是由于保存中乙醇氧化为乙醛所致, 其原因有待进一步研究。此外, 实验过程中有1支用柠檬酸钠（9:1）管采集、首次检测后在-18 ℃冷冻条件下保存了90 d的血液样品中, 复核检测含量比首次检测含量上升了3.51%, 其原因有待进一步研究。