引用本文
陈国林, 王学为, 李芳. 骨骼DNA快速检验方法[J].刑事技术, 2018,43(5):387-389
CHEN Guolin, WANG Xuewei, LI Fang. Rapid Examination of STR Genotyping from Bone DNA[J]. Forensic Science and Technology,2018,43(5): 387-389  
Doi: 10.16467/j.1008-3650.2018.05.009
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《刑事技术》编辑部
骨骼DNA快速检验方法
陈国林, 王学为, 李芳
丽水市公安局刑侦支队,浙江 丽水 323000

第一作者简介：陈国林（1976—）,男,浙江景宁人,学士,主检法医师,研究方向为法医物证学。 E-mail: cglcgl110@163.com

摘要

目的 探讨骨骼DNA提取与快速检验的方法。方法 取1年内的碎骨片37份,采用优化的PrepFiler BTA Forensic DNA试剂盒法提取DNA,以GlobalfilerTM Express复合扩增,经3130 xL基因分析仪电泳分离进行STR分型检测。结果 37份骨骼样本均获得完整的STR分型,各等位基因峰为200 ~7500rfu,峰型较均衡。结论 采用本文建立的骨骼DNA快速检验法提取骨骼DNA,检验时间短,STR分型结果好,可在实际检案中使用,特别适合于灾害事故遇难者身份识别（disaster victim identification, DVI）的身源鉴定。

关键词: 法医物证学; 骨骼; DNA提取; 快速检验法
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2018)05-0387-03
Rapid Examination of STR Genotyping from Bone DNA
CHEN Guolin, WANG Xuewei, LI Fang
Criminal Investigation Detachment of Lishui Public Security Bureau, Lishui 323000, Zhejiang, China
Abstract

Objective To explore the method of rapid STR genotyping with the DNA extracted from bones.Methods 37 pieces of bone chips, kept within one year, were selected to undergo the optimized disposal by PrepFiler BTA Forensic DNA kit to have the DNA extracted and the multiplex amplification carried out by GlobalfilerTM Express. Through the electrophoretic separation by the 3130 XL genetic analyzer, the relevant STR genotypes were obtained.Results All of the 37 skeletal samples have obtained their complete STR genotypes, with the peaks of all allelic genes between 200 ~ 7500rfu and the peak patterns showing in quite an equilibrium.Conclusion With its short examination time and better DNA STR genotyping, the here-established method can be used to rapidly extract and examine bone DNA for practical cases, particularly suitable for disaster victim identification (DVI).

Key words: forensic physical evidence; bone; DNA extraction; rapid examination

骨骼是DNA检验的一类特殊生物检材, 其具有致密组织结构, DNA降解速度相对人体其他组织慢。对于高度腐败和白骨化的尸体案件, 骨骼是DNA检验的首选检材, 但是由于其特殊的组织结构及环境因素影响, 骨骼DNA的提取较为困难。骨骼DNA鉴定的难点在于DNA拷贝低、有外源性DNA污染等[1], 因此保证充足的DNA模板量和避免外源性DNA污染是骨骼DNA检验成功的关键。

本文尝试应用ABI公司的PrepFiler BTA Forensic DNA试剂盒提取骨骼DNA, 结合GlobalfilerTM Express试剂盒进行STR分型检验, 在4.5 h内获得理想的分型结果。

1 材料与方法
1.1 检材来源

检材来源于本机构日常检案收取的自然灾害和分尸案中的骨骼样本, 共计37份。按人体部位分为颅骨5例, 胸骨2例, 椎骨8例, 掌骨7例, 跖骨4例, 髌骨5例, 股骨4例, 胫骨2例; 按尸体埋藏时间分为1~2周3例, 2~3周5例, 3~4周6例, 4~5周11例, 5~6 周4例, 6~7周1例, 7~8周1例, 28~29周4例, 41~43周2例。

1.2 方法

1.2.1 样本预处理

用纯水冲洗干净骨骼表面, 放通风柜中干燥后, 用75%酒精清洗, 再晾干。之后, 用手术刀片将骨骼表面附着物刮干净, 再用手术刀片切取或用压碎机压碎骨骼, 取骨密质或骨松质骨碎片约15~100 mg。取样时首选骨松质, 因其比骨密质所含细胞量多, 故DNA含量相对较多[2], 且骨松质结构相对疏松, 较易处理[3]。

1.2.2 DNA提取

将骨碎片置于1.5 mL离心管中, 采用优化的PrepFiler® BTA Forensic DNA试剂盒（ABI公司, 美国）提取, 步骤如下：1) 加入PrepFiler BTA Lysis Buffer 220 μ L, Proteinase K（ABI公司, 美国）10 ~ 20 μ L, DTT 溶液 （1 mol/ L）3 μ L; 震荡10 s, 1000 r/min离心3 s后, 将样本管放在恒温震荡金属浴孵育, 56 ℃孵育1 h。2) 将样品管用离心机10 000 r/min离心90 s, 将上清液转移到新的1.5 mL离心管中, 注意不要吸到沉积物, 如果转移的上清液过少, 需添加PrepFile BTA Lysis Buffer至总体积180 μ L。3) 在离心管中加入300 μ L PrepFiler Lysis Buffer、15 μ L磁珠、300 μ L异丙醇（99.5%分子级）, 震荡10 s以上, 在室温中静置10~20 min。4) 震荡样本管10 s, 离心3 s, 将样本管放置在磁力架（ABI公司, 美国）上静置3 min, 去除上清液, 注意不要碰触磁珠（下同）; 加入600 μ L PrepFiler Wash Buffer A洗涤液, 从磁力架上取下样本管震荡10 s, 离心3 s, 将样本管放置在磁力架上静置1 min, 去除洗涤液; 再次加入300 μ L PrepFiler Wash Buffer A洗涤液, 重复上面的清洗步骤。5) 加入300 μ L PrepFiler Wash Buffer B洗涤液, 震荡10 s, 离心3 s, 将样本管放置在磁力架上静置
1 min, 去除洗涤液; 继续在磁力架上晾干5 min。6) 洗脱DNA：在管中加入20 μ L的PrepFiler® Elution Buffer, 震荡至磁珠重悬, 将离心管放置在金属浴中70 ℃孵育10 min, 最大速度震荡离心管直到磁珠重悬再离心5 s, 将离心管放置到磁力架上静置3 min, 直到磁珠稳定, 小心将所有的液体转移到新的1.5 mL
离心管中备用。

1.3 PCR扩增与检测

使用GlobalfilerTM Express试剂盒（ABI公司, 美国）进行PCR扩增, 反应体系10 μ L, 其中DNA模板溶液1 μ L, PCR反应混合液9 μ L（含有Master mix additive的Master Mix 4μ L, Primer Mix 4 μ L, 纯水1 μ L）。采用9700型扩增仪（ABI公司, 美国）, 参照试剂盒扩增条件进行扩增。采用3130xL型基因分析仪（ABI公司, 美国）检测扩增产物, 应用GeneMapper ID-X v1.4软件进行STR分型。

2 结果

37份骨骼样本均获得了GlobalfilerTM Express扩增试剂盒中21个常染色体STR基因座和Amel基因座的分型结果, 其中的13份男性骨骼样本也获得了试剂盒中2个Y染色体基因座的分型结果, 各等位基因峰为200 ~ 7500 rfu, 峰型较均衡, 未见明显非特异性峰型（图1）。不同部位和不同埋藏时间骨骼样本的STR分型检验成功率均为100%。

图1 1例埋藏7~8周的胫骨STR分型图谱（GlobalfilerTM Express扩增试剂盒）Fig.1 STR genotyping profile by GlobalfilerTM Express to test one shinbone that was buried underground for 7-8 weeks

3 讨论

传统的骨骼DNA提取方法, 步骤较繁琐, 耗时也长。本文方法步骤简单、提取时间短且成功率高, 优点明显, 表现为：

1) 直接用刀片切取和压碎机压碎骨骼样本, 可防止研磨骨粉因产热而所致的DNA降解[4]。

2) 所用试剂盒中的裂解液PrepFiler BTA Lysis Buffer裂解能力强, 可直接裂解骨碎片且无需单独进行脱钙处理。而传统的骨骼DNA提取方法需要进行单独的脱钙处理, 会导致DNA的部分流失, 遗弃的脱钙液中往往含有大量的DNA, DNA损失会达50%以上[5]。而本文方法因无需作脱钙处理, 防止了DNA的丢失, 提高了DNA的产量。

3) 所用试剂盒中的纳米磁珠吸附核酸效果好, DNA回收率高, 多次洗涤又保证了DNA的高纯度。

4) 传统骨骼DNA提取方法脱钙时间较长, 一般在12 ~ 24 h以上[6, 7], 而本文方法同时进行脱钙和裂解, 直接裂解1 h即可, 使DNA提取在2 h内就能完成, 结合GlobalfilerTM Express扩增试剂盒进行快速扩增, DNA分型检验的整个过程在4.5 h就能完成, 非常适合灾害事故遇难者身份识别（disaster victim identification, DVI）的身源鉴定。

5) 37份骨骼提取DNA样本都获得了扩增试剂盒应显现的全部STR分型结果。该扩增试剂盒的SE33基因座片段长度约306 ~ 444 bp, 在低拷贝DNA扩增时容易丢失等位基因, 而在本实验中该等位基因未丢失。因此, 本文方法提取骨骼DNA的浓度、纯度都较高, 检验成功率高。

综上所述, 本文采用优化的PrepFiler BTA Forensic DNA试剂盒法结合GlobalfilerTM Express扩增试剂盒检验骨骼DNA大大缩短了检验时间, 具有操作简便、试剂无毒、所需样本量少、能快速获得完整DNA分型等优点, 适合骨骼检验使用, 特别在DVI快速检验中可选用。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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[5] 李花, 涂政, 石屹, 等. 骨骼脱钙后DNA含量损失问题初探[J]. 中国法医学杂志, 2014, 29(2): 141-144. [本文引用:1]
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[7] 贾东涛, 韩海军, 张玉红, 等. 陈旧骨骼DNA的提取方法的应用研究[J]. 中国法医学杂志, 2007, 25(4): 260-261. [本文引用:1]