硬质渗透性载体表面接触DNA的检验
严安心, 王冲, 凃政, 徐秀兰, 徐珍, 陈静, 李永久
公安部物证鉴定中心,北京100038

第一作者简介:严安心(1986—),男,河南周口人,硕士,法医师,研究方向为法医遗传学。E-mail:yananxin3088@163.com

摘要

本文介绍一种适用于石头、混凝土块等硬质渗透性载体表面接触DNA检验的新方法。首先,将一定浓度的茚二酮荧光显现试剂喷涂在渗透性载体表面,使其与接触痕迹中的氨基酸反应,产生荧光物质,在高能量532nm激光(绿光,50万lx照度)照射下激发出荧光,从而定位接触痕迹。然后,利用负压吸附的方法定点吸附接触部位的脱落细胞,提取出脱落细胞的DNA,即接触DNA。在一起杀人案STR分型检验中,应用该方法在关键物证石头、混凝土块表面分别获得了嫌疑人各自单一的DNA分型。茚二酮荧光显现试剂结合高能量激光照射技术可对微量接触痕迹灵敏、准确地定位,将其用于对硬质渗透性载体表面接触DNA的检验,采取“定位-定点吸附-STR分析”的技术路线可大大减少工作量,有效提高单一个体DNA分型的检出率。

关键词: 茚二酮; 激光; 负压吸附; DNA检验
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2018)04-0338-03
Detection of Touch DNA on the Hard and Permeable Objects
YAN Anxin, WANG Chong, TU Zheng, XU Xiulan, XU Zhen, CHEN Jing, LI Yongjiu
Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing 100038, China
Abstract

A new method was here introduced for detection of touch DNA on the hard and permeable objects (like stone, concrete block). First, 1, 2-indanedione, a special reagent which can react with amino acids to produce fluorescent substances, was sprayed on the hard and permeable objects. The 500000-lux illuminance, produc produced with an evidence-detecting laser device under 532nm laser, was to irradiate onto the 1, 2-indanedione-sprayed objects so that the strong fluorescence was excited from the fluorescent substances, exposing the exfoliative cells to be positioned. Then, the exfoliative cells were collected through a negative pressure absorption method and each of their DNA was extracted. Finally, STR analysis was carried out. In a homicidal case, the individual DNA typing of the suspects had been obtained from the respective surface of a stone and concrete block by the above method. The combination of 1, 2-indanedione detection reagent with high energy laser irradiation can locate the biological trace evidence with high sensitivity and accuracy. For touch DNA on the hard and permeable objects to be detected by the method established here, the adoption of “positioning-fixed-point absorption-STR analysis” can greatly reduce the workload and effectively improve the probability of obtaining individual DNA typing.

Key words: 1; 2-indanedione; laser; negative pressure absorption; DNA detection

接触DNA也称为脱落细胞DNA, 是指通过人体皮肤接触而遗留在载体表面上的DNA。Wickenheiser[1]的研究表明, 每人每天大约会自然脱落400 000个上皮细胞, 这成为接触DNA的主要来源。根据物质交换原理, 任何进入犯罪现场的个体只要与现场实物发生接触, 都会留下接触痕迹, 这成为DNA的检验基础。随着DNA检验灵敏度的不断提高, 大量可能载有接触DNA的检材越来越受到办案人员的重视[2]。载体属性、提取部位、检验策略等多种因素都会影响接触DNA的检出率[3]。在众多种类的检材中, 石头、混凝土块等检材由于受其质地坚硬、表面积大、表面粗糙、具渗透性、表面附着物多、组成成分中含PCR抑制物多等因素影响, 通常不利于脱落细胞的发现和提取, 是法医接触DNA检验的一大难点。本文通过对一起杀人案中石头、混凝土块上嫌疑人DNA的成功检验, 探索了硬质渗透性载体上接触DNA的检验方法。

1 案例资料
1.1 简要案情

某市发生一起命案, 某人被多人殴打, 致重度颅脑损伤而死。现场发现的石头、混凝土块被推断系致死工具。有关单位将石头、混凝土块等检材送检, 要求进行DNA检验。

1.2 案件检验

1.2.1 荧光检测

荧光显现剂由苏州晓松科技开发有限公司提供, 含有茚二酮、乙酸乙酯、甘油、乙醇、石油醚等成分, 工作液按试剂说明现配现用。

荧光显现:首先使用荧光显现剂对送检石头、混凝土块表面进行整体喷涂, 不留死角, 然后在相对湿度小于40%, 常温环境中放置1 h, 晾干(也可在80~85 ℃的环境下干燥15 min), 使用激光物证勘查仪(苏州晓松科技开发有限公司提供), 选择发射波长为 532 nm、光谱半高宽度小于1 nm的激光(绿光)对充分反应后的石头和混凝土块照射, 保持距离在30 cm以上且控制载体表面形成50万lx的照度, 使用只允许540 nm及以上光波通过的滤光镜(其它光波不能通过)观察石头和混凝土块表面荧光显现情况。

1.2.2 脱落细胞的收集和DNA提取

上述1.2.1中出现荧光反应的位置, 应为可能存在脱落细胞的部位, 使用生物脱落细胞提取仪(公安部物证鉴定中心研制)进行定点吸附, 时间约为20~30 s(每个部位均单独进行吸附提取), 取出滤膜, 剪碎, 置入1.5 mL管中, 加入200 μ L裂解液(QIAGEN M48 DNA提取试剂盒组分)和20 μ L蛋白酶K(5 mg/mL), 震荡后置于56 ℃保温2 h, 离心, 取上清。上清液采用QIAGEN M48 DNA提取试剂盒进行浓缩纯化。

1.2.3 STR分型检验

采用GlobalFilerTM PCR复合扩增试剂盒扩增, 产物经3500xL遗传分析仪检测, 以GeneMapper® ID-X 1.4软件进行STR分型。操作按试剂、仪器说明书进行。

1.3 检验结果

经荧光检测, 观察到在石头上有2处疑似接触痕迹, 在混凝土块上有3处疑似接触痕迹(部分痕迹的显现情况见图1)。对此5处疑似接触部位分别进行DNA提取检验。结果石头表面获得的DNA分型(图2上)与犯罪嫌疑人任某的一致; 混凝土块表面获得的DNA分型(图2下)与犯罪嫌疑人张某某的一致。

图1 表面接触痕迹的显现(箭头所指为疑似接触痕迹。a图载体为石头; b图载体为混凝土块)Fig.1 Exposal of the contact marks (indicated by the arrow) carrying human cells: (A) on the stone, (B) on the concrete block

图2 石头表面获得的DNA分型(上)和混凝土块表面获得的DNA分型(下)Fig.2 STR profiling of touch DNA from the surface of stone (upper) or concrete block (bottom)

2 讨论

人表皮脱落细胞, 虽然多为角质上皮细胞, 且细胞核多已退化, 但在出汗较多、皮肤与物品紧密摩擦的情况下, 仍会存留一定量的有核上皮细胞, 这些细胞是接触DNA的主要来源, 可以进行DNA检验。本文案例, 由关键物证疑似致伤工具(石头、混凝土块)上获得嫌疑人的DNA分型是该案DNA鉴定的重点和难点。如果采用整体擦拭或整体吸附的方法提取检材表面的脱落细胞, 会有以下问题:1)物体表面附着的PCR抑制成分将过多地被提取, 影响后续的扩增反应; 2)本案死者系颅脑损伤, 有少量出血, 整体提取可能会造成嫌疑人的脱落细胞被受害人的血迹掩盖或污染, 从而影响结果解读; 3)接触部位只占物体表面的一小部分, 整体提取由于不能准确定位, 带有一定的盲目性, 有可能会造成接触部位的漏提或提取不充分, 导致获得的细胞量不能满足DNA的检验需要。解决上述问题的最佳方案是先定位石头、混凝土块上的接触部位, 再进行定点提取, 从而在降低干扰物影响的同时提高获得单一个体DNA分型的可能性。

采用茚二酮荧光显现剂结合激光勘查技术对石头、混凝土块表面接触痕迹进行检测, 使抽象的触摸部位具象化, 而能实现肉眼观察。原理在于茚二酮能够与人体汗液中的氨基酸发生颜色反应, 在532 nm激光(绿光)照射下会产生高强度的荧光。有研究表明, 茚二酮显现潜在接触痕迹的灵敏度比DFO(1, 8-二氮-9-芴酮)及茚三酮高; 荧光效果也强; 且在背景复杂时, 可以更好地除去背景的干扰[4]。对于渗透性载体, 茚二酮溶液不仅与载体表面的汗液成分反应, 还能够与渗透至内部的汗液成分反应, 增加了反应产物, 进而增强了荧光效果。荧光物质本身具有特定的吸收光谱, 当激发光的光谱与荧光物质的吸收光谱相耦合时, 荧光物质分子吸收光能处于激发态; 因激发态不稳定, 将迅速回复到基态, 从而释放能量产生荧光。茚二酮与氨基酸反应产物的吸收光谱与绿光光谱相匹配, 在532 nm绿光照射下能够产生荧光。激光具有方向性好、单色性强、能量高度集中的特
[5], 是激发荧光物质发光的理想光源。在波长一定时, 激光的照度越高, 则单位面积上的光通量越大, 相同光照面积下所产生的激发态荧光物质分子就越多, 所激发的荧光也就越强, 检测的灵敏度相应也就越高。本案例中激光物证勘查仪输出的532 nm激光(绿光)能够在载体表面形成50万lx的照度, 笔者使用该强度激光成功观察到接触痕迹的荧光, 而使用多波段光源中的绿光(光谱纯度和光照强度都相对较低)进行观察却并未发现明显的荧光。本案例接触DNA的分型结果清晰准确, 各基因座等位基因间峰高均衡, 无等位基因缺失和非特异性扩增等情况, 说明茚二酮荧光显现剂和激光勘查技术的应用未对DNA的提取和扩增产生不利影响。

针对石头、混凝土块等硬质渗透性载体上脱落细胞的收集, 可以采用棉签擦拭、负压吸附和直接刮取等方法, 比较这三种方法, 负压吸附法的收集效果更好。一方面, 在相同的载体表面积下, 负压吸附比棉签擦拭收集到的细胞数量多。再者渗透性载体由于内部疏松多空, 脱落细胞容易伴随汗液等渗透其中, 棉签擦拭只能收集表层的细胞, 负压吸附则不仅能收集表层的细胞, 还能收集距表层较近的渗透细胞。另一方面, 负压吸附比直接刮取操作简单, 杂质也相对较少。石头、混凝土块的表面较为坚硬, 直接刮取操作也会较为困难; 而刮取下来的粉末成分复杂, PCR抑制物较多, 又不利于后续的扩增实验。

本文使用茚二酮荧光显现剂结合激光勘查技术成功定位石头、混凝土块表面上触摸痕迹, 采用负压吸附方法收集微量的脱落细胞, 通过该“ 定位-定点吸附-STR分析” 的技术路线, 分别获得了单一个体的DNA分型, 本案的成功检验对此类硬质渗透性载体上接触DNA的检验具有一定的借鉴意义。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。

参考文献
[1] WICKENHEISER R A. Trace DNA: a review, discussion of theory, and application of the transfer of trace quantities of DNA through skin contact[J] . Journal of forensic sciences, 2002, 47: 442-450. [本文引用:1]
[2] 陈松, 李万水, 胡兰, . 微量DNA: 容易忽略的生物物证[J] . 刑事技术, 2004(s1): 19-22. [本文引用:1]
[3] 张广峰, 陈松, 凃政, . 接触DNA检验成功率的影响因素探讨[J] . 刑事技术, 2013(3): 9-13. [本文引用:1]
[4] CHAMPOD C, LENNARD C, MARGOT P, et al. Fingerprints and other ridge skin impressions[M] . Boca Raton: CRC Press, 2004. [本文引用:1]
[5] 王桂强. 指印的光学显现和照相技术[M] . 北京: 群众出版社, 2005. [本文引用:1]