ACQUITY UPLCXevo TQ MS系统, Masslynx工作站( 美国Waters 公司) , Milli-Q 纯水系统( 美国Millipore 公司), BP210s 电子天平(德国Sartorius公司) , 东莨菪碱标准品（中国药品生物制品鉴定所, 纯度大于99.0%）, 右美托咪定标准品（美国DrEhrebstorfer, 99.0%）, 乙腈、甲酸铵为色谱纯, 水为去离子水, 其余试剂均为分析纯。

精确称取右美托咪定、东莨菪碱标准品各10.0 mg, 分别定容于10 mL的甲醇中, 配置成浓度为1.0 mg/mL的标准储备液, 在4 ℃冰箱中保存, 实验过程中根据需要, 用乙腈逐级稀释。

取血液样品1.0 mL, 用4 mL 0.1 moL/L的盐酸进行稀释, 振荡、离心（8000 r/min, 20 min）, 上清液经3 mL甲醇活化, 3 mL水、0.1 moL/L的盐酸润洗过的Oasis MCX固相萃取柱, 经3 mL 0.1 moL/L的盐酸、3 mL甲醇淋洗, 弃去淋洗液, 离心甩干萃取柱, 3 mL 2%氨水甲醇洗脱, 收集洗脱液, 50 ℃空气流下挥干, 500 μ L初始流动相定容, 过0.22 μ m有机相微孔滤膜, 供LC-MS/MS分析。

1.4.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱( 100 mm× 2. 1 mm, 1.7 μ m) , 柱温35 ℃。流动相A：乙腈; 流动相B： pH 9水溶液; 洗脱方式：梯度洗脱, 详见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 流动相梯度洗脱条件 Table 1 Gradient of mobile phase 时间/min A/% B/% 流速/( mL /min) 0.5 10 90 0. 50 1.5 60 40 0. 50 2.0 60 40 0. 50 2.1 90 10 0. 50 2.8 90 10 0.50 3.5 90 10 0.50

表1 流动相梯度洗脱条件 Table 1 Gradient of mobile phase

1.4.2 质谱条件

电喷雾离子源( ESI) , 正离子模式, 多反应监测模式( MRM), 毛细管电压1.0 kV, 去溶剂温度450 ℃, 去溶剂气流速1000 L/h。两种物质的质谱参数见表2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 东莨菪碱和右美托咪定的检测参数 Table 2 Mass spectrum parameters of scopolamine and dexmedetomidine 中文名称 定量离子 定性离子 锥孔电压/V 碰撞能量/V 东莨菪碱 303.8/137.9 303.8/155.9 30 26 303.8/137.8 16 右美托咪定 201.15/95.0 201.15/95.0 50 20 201.05/67.9 20

表2 东莨菪碱和右美托咪定的检测参数 Table 2 Mass spectrum parameters of scopolamine and dexmedetomidine

根据东莨菪碱和右美托咪定的结构特点, 选择电喷雾正离子电离模式, 取200 ng/mL东莨菪碱、右美托咪定标准溶液, 以20 µ L/min的速度直接进样, 分别对喷雾电压、毛细管温度、雾化流速及温度等参数进行优化, 通过全扫描方式观察, 得到目标化合物的准分子离子。通过碰撞反应进行离子扫描, 选择丰度较大的两个子离子作为定量离子和辅助定性离子, 目标物的质谱条件见表2。

实验考察了在ACQUITY UPLC^® HSS T3 、ACQUITY UPLC BEH C18两种不同柱子和酸性（pH=3）碱性（pH=9）条件下不同流动相对二者的分离效果。结果表明此两款柱子均可达到对二者的分离, 但在酸性条件下, 东菪莨碱因溶剂效应的影响, 存在前拖尾现象, 在ACQUITY UPLC BEH C18柱上碱性条件下分离, 其效果好, 灵敏度高、峰形对称, 分析结果见图1~3。

在选定的实验条件下, 分析空白血样, 不受血液中基质的干扰（见图4）, 东莨菪碱和右美托咪定具有良好的色谱峰, 保留时间分别为1.46 min 和1.89 min（见图5）。表明本方法具有良好的专属性。

图1

Fig.1

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	图1 BEH C18柱总离子流图 ( pH=3)Fig.1 TIC chromatogram of BEH C18 (pH=3)

图2

Fig.2

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	图2 HSS T3柱总离子流图( pH=3)Fig.2 TIC chromatogram of HSS T3 (pH=3)

图3

Fig.3

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	图3 BEH C18柱总离子流图(pH=9)Fig.3 TIC chromatogram of BEH C18 (pH=9)

图4

Fig.4

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	图4 空白血MRM色谱图Fig.4 MRM chromatogram of blank blood

图5

Fig.5

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	图5 空白血添加50ng标准物质的MRM色谱图Fig.5 MRM chromatogram of 50ng standard substance in blank blood

实验比较了液液萃取、乙腈沉淀蛋白和固相萃取3种方法对两种化合物的提取效果, 表明东莨菪碱液液萃取提取回收率低, 乙腈沉淀蛋白法简单快速, 但二者之间的回收率差异较大。针对固相萃取实验比较了OasisÒ HLB与OasisÒ MCX两种小柱, 相关数据见表3, 本实验最终选用萃取物干净、萃取效果好的OasisÒ MCX柱进行实验。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 乙腈沉淀蛋白、液液提取和固相萃取的平均回收率 Table 3 Average recovery rate of acetonitrile-precipitated protein, liquid-liquid extraction and solid phase extraction 目标物50 ng 回收率/% 沉淀蛋白 液液提取 固相萃取(HLB) 固相萃取(MCX) 东莨菪碱 102.0 62.5 60.4 86.7 右美托咪定 69.4 89.3 68.9 94.5

表3 乙腈沉淀蛋白、液液提取和固相萃取的平均回收率 Table 3 Average recovery rate of acetonitrile-precipitated protein, liquid-liquid extraction and solid phase extraction

毒物分析中最常用的基质效应评价方法是提取后加入法。本实验测定标准品溶液的色谱峰面积( S1) 和空白样品基质提取液添加标准溶液后的色谱峰面积(S2) , 以比值S2 /S1(%)来评价基质效应。实验对四种提取方法的基质效应做了比较, 结果显示OasisÒ MCX萃取的基质效应不明显, 血液中两种药物在10、50、100 ng /L 浓度时的基质效应值均在87.1%~107.6%之间。

血样1.0 mL若干份, 分别加入适量的东莨菪碱和右美托咪定标准工作液, 使二者在血液样品中的浓度分别为1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL, 按照1.3的方法进行提取, 1.4的方法进行分析, 以浓度对定量离子的峰面积进行线性回归, 得右美托咪定和东莨菪碱的回归方程分别为：y = 710.33x + 1652.4和y = 444.16x - 1087; 二者均在1.0~200.0 ng/mL 线性范围内关系良好, 相关系数分别为R²=0.9991和R²=0.9962。按信噪比（S/N）≥ 3, 计算得血液中二者的检出限均低于0.1 ng/mL。

取空白血液1.0 mL, 配制东莨菪碱和右美托咪定高、中、低3个浓度（10、50、200 ng/mL）的血液样, 每一浓度平行5份, 按照1.3和1.4项下的方法操作, 每个浓度同日内连续测定3次, 根据目标物特征离子峰面积计算回收率及日内精密度, 连续测定3 d, 计算日间精密度, 结果见表4。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 血液样本中东莨菪碱和右美托咪定的回收率及精密度（n=5） Table 4 Precision and recovery of scopolamine and dexmedetomidine in blood samples (n=5) 药物 血液添加浓度/ （ng/mL） 精密度RSD/% 回收率/% 日内 日间 东莨菪碱 5 8.22 10.4 81.9 50 3.67 5.21 84.5 100 3.26 6.14 93.1 右美托咪定 5 6.73 8.26 88.4 50 2.88 4.52 89.6 100 2.84 4.67 92.2

表4 血液样本中东莨菪碱和右美托咪定的回收率及精密度（n=5） Table 4 Precision and recovery of scopolamine and dexmedetomidine in blood samples (n=5)

2016年8月8日, 某市110指挥中心接警称, 某停车场一辆车内发现一具男性尸体。送检检材为胃内容及血, 经筛查, 胃内容中含有东莨菪碱和右美托咪定, 采用本文方法, 从血及胃内容中均检出右美托咪定和东莨菪碱, 血中右美托咪定和东莨菪碱的含量分别为49.4 ng/mL和142.0 ng/mL。