3颗来自不同个体保存完整的切牙（2011和2013年实际案件检材, 已做过检验, 获得了完整分型并和失踪人员的家属经亲缘关系鉴定确定了其来源）, 分别编为1、2和3号。

超敏DNA提取试剂盒（上海惠文生物科技有限公司）; Identifiler-Plus扩增试剂盒（Thermo Fisher公司, 美国）; 5% (质量浓度)次氯酸钠溶液; 无水乙醇; 0.5mol/L EDTA脱钙液（pH 8.0）; DTT溶液(1 mol/L)以及蛋白酶K溶液(20 mg/mL)等。

三颗牙齿分别用清水洗净表面, 再以手术刀片刮去牙齿表层及污垢物, 用蒸馏水冲去浮垢, 放入干净小烧杯中, 加5% 次氯酸钠溶液浸泡15 min^[1]后弃去溶液, 蒸馏水泡洗3~5次, 清除次氯酸钠, 无水乙醇泡洗1次除去残余水份, 用滤纸拭干, 以紫外光照射各牙齿30 min。使用自制的牙齿粉碎器将三颗经预处理的牙齿分别研成粉末。

图1为牙齿粉碎器, 由三部分组成。为减少磨损度以增加使用期限, 其各部分表面均镀有金属铬。左侧为底座, 半球形设计用以放置牙齿和收集牙粉, 右侧为套管, 套在底座和中间的圆柱上, 用以防止牙齿四处溅落, 并固定用力的方向。使用时, 左侧底座凹槽用于放置已清洁的牙齿; 右侧套管套在左侧底座之上; 中间的圆柱形铁块上端球形面用于与底座凹槽相嵌合, 下端平面则用于接受铁锤等击打物敲击。

图1

Fig.1

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	图1 自制牙齿粉碎器Fig.1 Self-made device for tooth grinding

将每颗牙研粉均取两份, 每份0.1 g, 置于两个超敏DNA提取试剂盒配套的离心套管内（编号为A和B）, 分别加入260 μ L预先混匀的试剂（包含有试剂盒中100 μ L裂解液A、20 μ L裂解液B以及20 μ L DTT溶液、20 μ L蛋白酶K溶液和100 μ L EDTA脱钙液）, 56 ℃裂解6 h, 99 ℃裂解10 min。而后, 13 000 g离心10 s, 再加入吸附液200 μ L, 1 3000 g离心2 min, 加入吸附液950 μ L及混匀的吸附珠悬液16 μ L, 室温静置15 min。8000 g离心30 min, 充分移去上清液, 先在A管沉淀物中加入-20 ℃漂洗液750 μ L, 充分混匀后将A管中的液体移至B管, 并将B管沉淀物充分混匀。 8000 g离心30 min, 充分去除漂洗液, 管盖打开状态下56 ℃烘干吸附珠1 min。加入洗脱液30 μ L, 充分混匀后56 ℃保温15 min。8000 g离心30 s, 取上清液备用。

采用Identifiler Plus扩增试剂盒扩增, 反应总体积25 μ L, 其中包含前面提取的牙齿DNA上清液10 μ L。热循环条件按试剂盒推荐参数设定。

扩增产物经3130 xL遗传分析仪检测, 电泳按说明书规定进行, 以GeneMapperID-X软件作STR分型。

三颗牙齿的STR分型结果都与档案室保存的STR分型结果一致, 均可满足尸源认定要求（如图2）。

图2

Fig.2

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	图2 1号牙齿STR分型Fig.2 STR genotype of the tooth 1

牙齿是白骨化尸体检验中的常见检材, 从牙齿中提取DNA做STR分型是对白骨化尸体进行尸源鉴定的重要手段。但由于牙齿中的细胞含量相对较少, 加之受时间、环境等因素的影响, 故牙齿的DNA提取成为法医DNA检验的一大难点^[2]。牙齿DNA提取可利用EDTA的脱钙作用软化骨组织, 再结合蛋白酶K和表面活性剂对细胞裂解, 可释放出深层骨组织中的DNA。骨骼脱钙后DNA检测结果证实明显优于未脱钙处理, 表明脱钙有助于细胞的分散, 会使骨粉变得粘稠细腻, 易被裂解液充分消化^[3]。但由于DNA是水溶性大分子, 单独的脱钙步骤会因弃去脱钙液导致DNA损失, 有研究^[4]表明遗弃的脱钙液中含有大量DNA, 损失率高达50%以上。

本方法使用超敏DNA提取试剂盒, 经硅珠吸附提取DNA, 脱钙液直接和裂解液、DTT、蛋白酶K以及牙齿粉末混合使用, 省去了单独的脱钙步骤从而减少了因弃脱钙液导致的DNA损失。另外, 使用硅珠试剂盒提取DNA的操作过程与步骤也相对简单, 尤其无需移管, 从而既有效减少了DNA损失又缩短了检验时间。

目前, 国内DNA实验室进行牙齿DNA检测时, 通常需要一颗磨牙的1/3。这些牙粉放置在1.5 mL离心管中裂解时, 由于重力作用会产生积压, 使骨粉不能和脱钙液、裂解液、DTT、蛋白酶K混合液等充分接触, 因之降低了脱钙液和裂解液的效能。为解决这个问题, 本方法使用两个超敏DNA提取试剂盒离心套管, 既增大了反应体系的体积也充分增加了裂解液与牙粉的接触面积, 从而提高了脱钙和裂解效能。然后在漂洗步骤时再将两个离心管的溶液合并接受漂洗与洗脱处理, 就使最终的DNA浓度大大增加, STR的分型结果更好。

本方法在相关骨骼DNA提取研究^[5]中也有类似应用, 其实质都是简化实验操作步骤、增加脱钙裂解效能、浓缩纯化DNA的含量。目前, 本实验室使用该方法提取牙齿DNA已有18宗案例, 全部获得了完整的STR分型, 其中有8宗案例和失踪人员的家属经亲缘关系鉴定确定了尸源。

综上, 利用超敏DNA提取试剂盒提取牙齿DNA, 能够获得良好的STR分型。本方法尤其适用于一些检材量少或者时间紧急的案件。至于时间更长（5年以上）的牙齿是否适用, 暂未研究, 待再积累检材后作探讨。