引用本文
韩文明, 张庆霞, 王顺霞, 刘金杰, 赵怡. SureID® PanGlobal试剂盒的法医学验证 [J].刑事技术, 2018,43(3):210-214
HAN Wenming, ZHANG Qingxia, WANG Shunxia, LIU Jinjie, ZHAO Yi. Forensic Validation for the SureID® PanGlobal Kit [J]. Forensic Science and Technology,2018,43(3): 210-214  
doi: 10.16467/j.1008-3650.2018.03.008
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《刑事技术》编辑部
SureID® PanGlobal试剂盒的法医学验证
韩文明1, 张庆霞2, 王顺霞2, 刘金杰2, 赵怡2
1. 北京市公安局大兴分局刑侦支队,北京102612
2. 北京市公安司法鉴定中心,北京100192

第一作者简介：韩文明（1982—）,男,山西大同人,双学士,主检法医师,研究方向为法医学。E-mail:king1398@163.com

摘要

目的 测试SureID® PanGlobal人类DNA身份鉴定试剂盒（简称SureID® PanGlobal试剂盒）的技术性能指标,评估其法医学应用价值。方法 根据GA/T 815-2009标准,从检测灵敏度和准确性、峰均衡性、常见动物的种属特异性、各种常见检材的适应性和一致性、对酶切降解和混有抑制剂检材的耐受性、不同批次间试剂的稳定性及混合样本的检测等9个方面对SureID® PanGlobal试剂盒进行测试。结果 SureID® PanGlobal试剂盒内标及Ladder符合GA/T 815-2009标准的要求,阳性样本分型正确,检测的灵敏度和均衡性也均较高,不同批次的试剂反复冻融10次后仍可获得正确分型,对降解检材及混有抑制剂的样本具有一定的耐受性,能检测不同类型的检材,具有种属特异性和混合样本检测能力。结论 SureID® PanGlobal试剂盒的上述性能指标符合GA/T815-2009标准的要求,达到了目前常用STR检测试剂盒的技术水平,可用于个体识别、亲权鉴定及遗传学分析,适合法医学检案与建库应用。

关键词: 法医物证学; 短串联重复序列（STR）; SureID® PanGlobal人类DNA身份鉴定试剂盒;
中图分类号:DF795.2 文献标志码:A 文章编号:1008-3650(2018)03-0210-05
Forensic Validation for the SureID® PanGlobal Kit
HAN Wenming1, ZHANG Qingxia2, WANG Shunxia2, LIU Jinjie2, ZHAO Yi2
1. Criminal Investigation Detachment, Daxing Branch of Beijing Public Security Bureau, Beijing 102612, China
2. Forensic Science Service of Beijing Public Security Bureau, Beijing 100192, China
Abstract

Objective To evaluate the technical performance and forensic applicability of the SureID® PanGlobal Human DNA Identification kit.Methods In compliance with the GA/T 815-2009, the SureID® PanGlobal kit was verified in nine terms of sensitivity, accuracy, balance, species specificity, adaptability, consistency, stability, survivability and mixed samples.Results The SureID® PanGlobal kit meets the professional requirements with its internal standard and ladder, together with the accuracy of positive controls, the excellent detection sensitivity, the balance and the species specificity. All the results were correct with 10 repetitive freezing-thawing cycles of the kit. The endurance was shown by the kit against either the degraded or the inhibitor-spiked DNA samples under certain conditions. The genetic polymorphisms were successfully detected with a variety of diversely-disposed DNA samples, along with the consistency of their genotyping results.Conclusions All the tests demonstrated that SureID® PanGlobal Human DNA Identification kit is adaptive to the requirements for the human fluorescent STR multiplex PCR reagent. Since its technical level has reached up to that of the similar international products, the kit can be used in personal identification, paternity test and genetic analysis, suitable for handling actual criminal cases and DNA database building.

Key words: forensic biological evidence; short tandem repeats (STR); SureID® PanGlobal Human DNA Identification kit;

SureID® PanGlobal人类DNA身份鉴定试剂盒是国产六色荧光标记STR复合扩增试剂盒, 可同时检测24个常染色体STR基因座、2个Y染色体STR基因座及Amelogenin, 其涵盖了美国FBI推荐的CODIS核心基因座、欧洲的ESS核心基因座及常用商品试剂盒中的PentaE、PentaD、D2S1338、D19S433、D6S1043基因座, 同时针对少数男性个体存在AmelY染色体片段缺失及引物结合区突变而导致的性别误判, 该试剂盒增加了Y-indel和DYS391基因座以补充验证。

现今DNA检验结果作为法庭科学的重要证据而可直接服务于侦查破案, 因此世界各国对法医DNA技术的新方法、新产品都有严格的标准。随着国产DNA试剂盒的研发和生产, 公安部及相关单位专家为保证试剂质量及检案的可靠性, 根据我国DNA检案的实际情况, 参照DNA分析方法科学工作组的确证指南（Revised Validation Guidelines, 2004）[1], 制定了我国DNA试剂盒的检测标准GA/T 815-2009《法庭科学人类荧光标记STR复合扩增检测试剂质量基本要求》[2]。本研究参照上述标准对SureID® PanGlobal试剂盒检测的灵敏度和准确性、峰均衡性、常见动物的种属特异性、各种常见检材的适应性与一致性、对酶切降解和混有抑制剂检材的耐受性、不同批次间试剂的稳定性及混合样本的检验等9个方面进行检测, 测试其各项技术性能指标, 评估其法医学应用价值。

1 材料与方法
1.1 仪器及试剂

AB7500型荧光定量PCR仪、AB9700型PCR扩增仪、AB3130xL/3500xL测序仪、GlobalFilerTM PCR试剂盒（以上仪器及试剂均购自美国ThermoFisher）, SureID® PanGlobal人类DNA身份鉴定试剂盒（宁波海尔施基因科技有限公司）, DB-100A自动打孔机（达博）, Maxwell自动提取仪（美国Promega公司）, Chelex-100, DNA阳性对照样本9947A及9948（浓度均为10ng/µ L）, 不同类型检材及人员血卡（均来自于日常检验与建库）, 常见动物DNA样本（由中科院动物研究所提供）, Alu I DNA内切酶, HaeⅢ DNA内切酶, QIAGEN纯化试剂盒, 靛蓝, 血红素等。

1.2 实验操作

本文实验过程如无特别说明, 均按照SureID® PanGlobal试剂盒说明书上推荐的最佳模板量及扩增体系操作。

1.3 样本的制备及性能指标检测

1.3.1 灵敏度检测

取10 ng/µ L的9947A及9948标准品进行稀释, 并使用AB7500型荧光定量PCR仪进行定量, 使其终浓度分别为1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.0625 ng/µ L, 各取1 µ L进行平行检测并重复1次。

1.3.2 准确性检测

取1.3.1中浓度为1.000 0 ng/µ L的9947A和9948各1 µ L分别检验2次, 判断分型结果与说明书的描述是否一致; 并从血样库中随机抽取369名人员的血卡分别用GlobalFilerTM PCR试剂盒及SureID® PanGlobal试剂盒进行检测, 观察结果是否一致。

1.3.3 均衡性检测

取1.3.1中浓度为1.000 0 ng/µ L的9947A及9948分别检验两次, 分析各个基因座等位基因的峰值, 并按以下方法进行计算：1）同一基因座等位基因间的均衡性：基因分型为杂合子的, 低峰峰值除以高峰峰值。2）同一荧光标记下各个基因座间的均衡性：将同一荧光标记下各个基因座中纯合子峰值除以2, 杂合子峰值取平均值, 用最小值除以最大值。3）不同荧光标记物间的均衡性：分别计算每一种荧光标记下所有基因座峰值的平均值, 用最小平均峰值除以最大平均峰值。

1.3.4 种属特异性检测

将猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、犬、猫、鼠、兔、鱼、马、猴、黑猩猩等常见动物的DNA样本及大肠杆菌的DNA样本均定量至1.0 ng/µ L, 各取1 µ L进行检测。

1.3.5 适应性检测

取已知分型的血痕、肌肉、骨骼、唾液斑、精斑、脱落细胞及带毛囊的毛发各两份, 分别按GA/T 383-2014[3]中的磁珠法及Chelex法提取DNA, 以AB7500型荧光定量PCR仪进行定量, 使其终浓度均为1.0 ng/µ L, 各取1 µ L进行平行检测。

1.3.6 一致性检测

取1.3.5中终浓度为1.0 ng/µ L的不同类型的提取产物各两份, 由两人分别用不同AB9700型PCR扩增仪扩增, 以AB3130xL和AB3500xL测序仪分别检测, 观察结果的一致性。

1.3.7 稳定性检测

将两个批次的SureID® PanGlobal试剂盒中各组分置于-20 ℃和室温下反复冻融10次, 检测阳性对照样本9947A及9948, 观察结果是否稳定。

1.3.8 耐受性检测

酶降解样本的检测[4], 取1.3.1中浓度为1.000 0 ng/µ L的9947A 17 µ L与1 µ L Alu I DNA内切酶、3 µ L酶切缓冲液、2 µ L BSA混合, 37 ℃恒温水浴1 h以上, 再与HaeⅢ DNA内切酶1 µ L、酶切缓冲液2 µ L混合, 37 ℃恒温水浴60 min。酶切反应后, 用Qiagen试剂盒纯化, 浓缩至2 µ L, 取1 µ L进行检测。

混有抑制剂的样本检测[5], 取1.3.1中浓度为1.000 0 ng/µ L的9947A 10 µ L与240 mmol/L的靛蓝1 µ L混合, 取1 µ L进行检测; 取1.3.1中浓度为1.0000 ng/µ L 9947A 5份, 分别加入血红素, 使其终浓度分别为5、10、20、40、80 µ mol/L, 各取1 µ L进行检测。

1.3.9 混合样本检测

将1.3.1中浓度均为1.000 ng/µ L的9947A和9948按照19:1、9:1、4:1、7:3、3:2、1:1、2:3、3:7、1:4、1:9、1:19的比例混合, 各取1 µ L进行平行检测。

2 结果与讨论

SureID® PanGlobal试剂盒的等位基因分型标准物包括中国人群中常见等位基因, 各个等位基因分型结果在规定范围内与说明书描述完全一致, 图谱清晰。所有等位基因峰高均大于200RFU; 每个基因座相邻两个等位基因峰高的比例大于50%, 各等位基因峰高均衡性大于20%; 同一基因座的两个相邻等位基因间片段差在预期范围内, 相邻两个基因座间无等位基因重叠; 在等位基因范围内出现的非等位基因均低于相邻等位基因峰高的20%。分子量标准条带清晰明确, 片段位置及数量与说明书描述完全一致, 与重复检验的等位基因分型标准物间标准偏离< ± 0.2bp, 每个片段的峰高> 200RFU（图1）。

图1 SureID® PanGlobal试剂盒内标检测图谱Fig.1 The spectrum of internal standards detected by the SureID® PanGlobal kit

2.1 准确性检测

SureID® PanGlobal试剂盒对369名随机个体血样的检测结果与GlobalFilerTM PCR试剂盒的检测结果在相同基因座分型完全一致。阳性对照样本9947A和9948分型正确, 未出现等位基因丢失现象, 等位基因的碱基数与Ladder偏差< ± 0.5bp, 部分基因座出现的Stutter峰均在主峰的10%以下（图2）。表明SureID® PanGlobal试剂盒能够准确判定基因型。

图2 SureID® PanGlobal检测9947A（左）和9948（右）图谱Fig.2 The profiles of 9947A (left) and 9948 (right) positive controls tested with SureID® PanGlobal kit

2.2 灵敏度检测

按照SureID® PanGlobal试剂盒说明书上推荐的扩增反应体系, 分别对1.0000、0.5000、0.2500、0.1250、0.0625 ng的9947A及9948进行扩增并检测, 结果0.0625 ng的9947A及9948出现2个大片段STR基因座等位基因丢失现象, 且峰的均衡性降低; 0.1250 ng以上的9947A及9948均能检出全部STR基因座分型。表明该试剂盒灵敏度较高, 能够对微量检材进行检验。

2.3 均衡性检测

实验数据按照1.3.3方法计算, 结果如下：各个基因座的等位基因均衡性≥ 77.03%, 同一荧光标记下各基因座间的均衡性≥ 62.37%, 不同荧光标记间均衡性≥ 66.00%。峰值均衡表明该试剂盒能够检测出样品的所有等位基因。

2.4 种属特异性检测

通过对猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、犬、猫、鼠、兔、鱼、马、猴、黑猩猩及大肠杆菌的DNA样本进行检测, 未检出特异性分型。说明SureID® PanGlobal试剂盒具备种属特异性, 可区分人与非人。

2.5 适应性检测

已知分型的血痕、肌肉、骨骼、唾液斑、精斑、脱落细胞及带毛囊的毛发等检材均获得完整、正确的DNA分型结果。说明SureID® PanGlobal试剂盒对各类案件中常见检材具有很好的适应性。

2.6 稳定性检测

两个批次的SureID® PanGlobal试剂盒中各组分反复冻融2、4、6、8、10次后, 9947A及9948的检验结果均无明显变化, 未出现信号大于50RFU的随机伪峰。说明该试剂盒具有较强的抗冻融能力, 检测结果稳定。

2.7 一致性检测

在不同的人员、设备条件下, 对同一样本进行重复性检验, 其分型结果一致; 对已知分型的同一批样本检验时, SureID® PanGlobal分型结果与已知分型结果一致。

2.8 耐受性检测

SureID® PanGlobal试剂盒对内切酶处理的降解样本可以检测到250 bp以内的基因座分型, 大片段基因座存在等位基因丢失现象（图3左）; 对影响PCR的抑制剂如靛蓝和血红素, 靛蓝< 240 mmol/L、血红素< 40 µ mol/L均得到完整的分型结果（图3右及图4）。说明该试剂盒对不同条件下的检材具有一定的耐受性。

图3 左图为经内切酶消化的9947A, 右图为被血红素抑制的9947AFig.3 The spectrums of 9947A either digested by endonuclease (the left part of this picture) or inhibited by heme (the right part of this picture)

图4 左图为血红素< 40 µ mmol/L的9947A, 右图为靛蓝< 240 mmol/L的9947AFig.4 The spectrums of 9947A inhibited with either the heme (< 40µ mol/L) (the left part of this picture) or the indigo (< 240mmol/L) (the right part of this picture)

2.9 混合样本检测

不同比例的混合样本检验结果显示：9947A与9948的混合比例为19꞉1、9꞉1、1꞉9、1꞉19时, 出现部分基因座等位基因丢失现象; 混合比例为4꞉1、7꞉3、3꞉2、1꞉1、2꞉3、3꞉7、1꞉4时, 可以准确得到混合样本的全部等位基因分型, 且混合分型中主要与次要成分峰高呈现的递增及递减趋势与混合比例基本相符（图5）。通过对两个样本不同混合比例的检测, 证明SureID® PanGlobal试剂盒能够检验混合样本。

图5 SureID® PanGlobal检测混合样本的分型结果（9947A꞉9948=4꞉1）Fig.5 The genotyping of the pooled sample (9947A:9948=4:1) tested with SureID® PanGlobal kit

3 结论

通过对SureID® PanGlobal试剂盒9个方面的测试, 其检验结果准确、稳定, 检测的灵敏度、种属特异性及峰值的均衡性均较高, 试剂的抗冻融能力也较好, 对不同类型检材及提取方法都有很好的适应性及一致性, 对酶切降解样本及混有抑制剂的样本具有一定的耐受性, 对混合样本具有较高的检测分析能力, 能够对4:1比例混合的样本正确分型。SureID® PanGlobal试剂盒的上述性能指标符合《法庭科学人类荧光标记STR复合扩增检测试剂质量基本要求》, 达到了目前常用STR检测试剂盒技术水平[6, 7, 8], 可用于个体识别、亲权鉴定及遗传学分析, 适合法庭科学检案与建库。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。

参考文献
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