STRtyper -21G直扩试剂盒检验37 737例检材, 共检出疑似三带型26例, 未出现单一样本有2个或2个以上基因座3条带的情况, 经PowerPlex21、Globlefiler试剂盒验证, 21例确证为三带型（表1）, 分型结果相同, 且峰高比例也一致, 2例排除, 多出的一条带为相邻基因座的稀有等位基因, 3例不能定论。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 检出三带型的基因座 Table 1 Loci harboring three-banded patterns 基因座 基因座定位 (是否位于编码蛋白区) 样本 三带型 峰高比例 STRbase 是否收录 类型 FGA 4q(是) 1 23/27/28 3꞉2꞉1 否 Type1型 2 22/23/24 3꞉2꞉1 是 Type1型 3 22/23/24 3꞉2꞉1 是 Type1型 4 22/23/24 3꞉2꞉1 是 Type1型 TPOX 2p(是) 5 8/10/11 1꞉1꞉1 是 Type2型 6 8/11/12 1꞉1꞉1 是 Type2型 7 8/9/11 1꞉1꞉1 是 Type2型 8 8/11/12 1꞉1꞉1 是 Type2型 PentaE 15q(是) 9 14/15/16 3꞉2꞉1 否 Type1型 10 14/15/19 1꞉2꞉3 否 Type1型 11 18/19/20 3꞉1꞉2 否 Type1型 D6S1043 6q 12 12/13/14 2꞉1꞉1 否 Type1型 13 12/13/18 1꞉1꞉1 否 Type2型 14 12/13/18? 4꞉1꞉4 CSF1PO 5q (是) 15 10/12/13 2꞉1꞉1 是 Type1型 16 10/11/12? 4꞉1꞉4 vWA 12p-pter(是) 17 18/19/20 1꞉1꞉1 是 Type2型 18 14/15/16 3꞉2꞉1 是 Type1型 D5S818 5q 19 10/12/13 3꞉2꞉1 是 Type1型 20 10/11/12 2꞉1꞉3 是 Type1型 D13S317 13q 21 10/11/12 2꞉1꞉1 是 Type1型 22 10/11/12? 4꞉1꞉4 D12S391 12p 23 18/19/20 3:2:1 否 Type1型 D1S1656 1q 24 15/18/19 3:2:1 否 Type1型 注：“ ?” 表示不能定论

表1 检出三带型的基因座 Table 1 Loci harboring three-banded patterns

2.2 检出三带型的特征

本研究共检测20个STR基因座, 有10个基因座检出21例三带型（表1）, 检出总频率为0.0556% (21/37737), 其中FGA、TPOX基因座检出率最高, 二者均为0.0106%（4/37737）, 其次为PentaE基因座, 为0.0079%（3/37737）; D5S818、vWA、D6S1043分别为2例; CSF1PO、D13S317、D12S391和D1S1656分别为1例。CSF1PO、D13S317和D6S1043各1例不能定论。21例三带型共有6种峰高比（图1）, 分别为3꞉2꞉1(42.86%, 9/21), 1꞉1꞉1(28.57%, 6/21), 2꞉1꞉1(14.29%, 3/21), 2꞉1꞉3(4.76%, 1/21), 3꞉1꞉2(4.46%, 1/21), 1꞉2꞉3(4.767%, 1/21)。不能定论的3例样本峰高比为 4꞉1꞉4（图1）。

图1

Fig.1

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	图1 7种不同类型峰高比分型图谱Fig.1 Seven-type STR profiles of three-banded pattern with various peak height ratios

正常人是二倍体, 常染色体单个STR基因座的等位基因分型表现为纯合子或杂合子, 纯合子个体图谱表现为只有1条带或者1个峰, 杂合子个体图谱表现为2条带或者2个峰。个别情况下, 单个STR分型图谱会出现3条带或3个峰, 且检测结果可重复, 此种情况就是所谓的三带型。对三带型的判读, 应首先排除污染、混合样本、基因嵌合体或移植嵌合体等因素。若单个基因座出现三带, 还要注意排除荧光染料污染峰、pull-up峰、非特异性带、相邻基因座出现过大或过小的稀有等位基因恰好位于疑似“ 三带型” 基因座ladder范围内等因素^{[1, 2, 3]}。而后, 再通过不同试剂盒对照验证, 最终才可确认为三带型等位基因^[4]。

本研究通过对37 737例健康无关个体进行20个STR基因座的分型分析, 获得26例疑似三带型样本, 用相同的试剂盒复核, 排除了污染、混合样本等原因, 再用PowerPlex21、Globlefiler两种不同的试剂盒进行验证确认, 所有分型结果均相同, 且峰高比例一致（图2、3）, 最终确认检出的21例个体确实存在三带型等位基因, 2例为跨基因座稀有等位基因（图4）。共有10个基因座检出三带型, 检出总频率为0.0556 %, 主要分布在FGA、TPOX、PentaE和D6S1043基因座, 这与国内研究的出现三带型的基因座分布有出入^{[5, 6, 7, 8]}, 其原因可能为群体样本来源及统计数量差异造成。试验采用的STRtyper -21G试剂盒包含有以蛋白质编码链命名的基因座6个, 非蛋白质编码链命名的基因座14个和1个性别基因座。21例三带型分布于10个基因座, 其中存在于蛋白质编码链命名的基因座14例、非蛋白质编码链命名的基因座7例, 两者比率为4.67/1, 推测位于蛋白质编码链区的基因座更易发生三带型, 这可能涉及到蛋白质功能, 或者与某种疾病相关^{[2, 9]}。

图2

Fig.2

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	图2 峰高比为4꞉1꞉4时不同试剂盒验证图谱Fig.2 STR profiles validated with different kits for the allele showing peak ratio of 4꞉1꞉4

图3

Fig.3

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	图3 峰高比为3꞉2꞉1时不同试剂盒验证图谱Fig.3 STR profiles validated with different kits for the allele showing peak ratio of 3꞉2꞉1

图4

Fig.4

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	图4 D21S11基因座稀有等位基因不同试剂盒验证图谱Fig.4 STR profiles validated with different kits for the rare alleles in D21S11 locus

Clayton把三带型分为2类^[3]：最常见的是Type1型, 表现为三个峰高不均衡, 典型代表特征是其中两个峰的峰高之和约等于另一个峰, 其发生原因可能与杂合子基因座体细胞突变有关; 其次是Type2型, 表现为三个峰的峰高接近, 其发生原因可能与杂合子基因座染色体重排有关。按照这一原则, 本次研究观察到的3꞉2꞉1、2꞉1꞉1、2꞉1꞉3、3꞉1꞉2和1꞉2꞉3属于Type1型（15/21）, 1꞉1꞉1属于Type2三带型(6/21)。相比其他学者报道的2꞉1꞉1或者1꞉1꞉1^{[5, 6, 7, 10, 11]}的三带型峰高比值, 本文检测到的类型更多, 推测与群体样本更大有关。

值得注意的是, 本次试验中有3例样本均有一个基因座峰高比为4꞉1꞉4, 其特点是两个峰较高且相对均衡, 低峰约为高峰的1/4, 高于stutter峰范围（如图1、2中PowerPlex21检测图谱）, 为排除可能存在污染或者其它非特异峰情况, 作者又对检材重新提取, 使用相同试剂盒、不同试剂盒、单基因座扩增进行了验证, 发现该低峰始终存在, 且同一样本中其它基因座、同批次试剂扩增的其它样本stutter均在正常范围, 故推测出现这种现象可能与样本来源有关。考虑到三带型、stutter峰产生的机理比较复杂, 确认该低峰类型还需进行测序或者其它方法予以证实, 在此, 作者仅对观察到的该现象予以报道, 以供研究者参考。

截止目前, 查询STR数据库(http://www.cstl. nist.gov/biotech/strbase/), 共收录三带型等位基因388例, 本研究的21例三带型中有8例三带型未被收录（见表1）; D21S11共收录等位基因45个, 本试验经不同试剂盒验证确认的稀有等位基因10、47均未被收录（图4）, 检验结果同时提示, D21S11出现跨基因座稀有等位基因的可能性较大, 数据分析时, 应当引起重视。当数据整体较为平衡、杂合子纯合子峰高比例也合理, D21S11基因座表现为一条带, 而相邻基因座等位基因为三条带或者为两条带但峰高比例严重不均衡时, 应考虑到其中的一条带可能为D21S11基因座的跨基因座等位基因。

综上, 典型峰高比为2꞉1꞉1或1꞉1꞉1的三带型应该不难判定。峰高差异大的三带型, 如3꞉2꞉1, 判读需慎重, 因极易出现漏判或者错断, 数据分析时应首先要保证仪器处于最佳状态, 灵敏度高; 其次, 扩增时加入的模板纯度要好, 浓度适当, 严格按试剂盒说明设置循环参数; 再是扩增产物电泳结果基线平, 图谱均衡, stutter峰处于正常范围, 无双肩峰、pull-up峰干扰以及不存在非特异性带。在此基础上, 若单个基因座出现三带, 应使用不同试剂盒验证, 必要时进行单基因座扩增和测序确定。